IDENTIFIKASI DAN POTENSI ANTIOKSIDAN FLAVONOID … · masyarakat Indonesia, jauh sebelum obat-obatan modern dikenal. Berkembangnya prinsip back to nature meningkatkan ... salah satu

IDENTIFIKASI DAN POTENSI ANTIOKSIDAN FLAVONOIDKULIT KAYU MAHONI ( Swietenia macrophylla KING)

OLGA MARDISADORA

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

ABSTRAK

OLGA MARDISADORA. Identifikasi dan Potensi Antioksidan Flavonoid KulitKayu Mahoni (Swietenia macrophylla King). Dibimbing oleh DJAROT SHAMISENO dan SYAMSUL FALAH.

Kulit kayu mahoni sebagai limbah industri pengolahan kayu belum banyakdimanfaatkan dibandingkan bagian lain dari tanaman mahoni. Penelitian inidilakukan untuk mengidentifikasi kandungan flavonoid dari kulit kayu mahonidan perannya sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan dari ekstrak kulit kayumahoni diukur dengan menggunakan dua metode yaitu metode 1,1-diphenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) dan metode tiobarbituric acid (TBA). Identifikasiflavonoid (kuersetin) dilakukan menggunakan HPLC dan KLT sedangkan ujiantioksidan flavonoid (kuersetin) dilakukan dengan metode DPPH. Daya hambatekstrak kulit kayu mahoni pada metode DPPH untuk ekstrak metanol, n-heksana,dietil eter, etil asetat, vitamin E, (kontrol positif) dan air pada konsentrasi 50 ppmadalah masing-masing sebesar 81.33%, 12.74%, 23.40%, 65.54%,30.42%, dan68.04%. Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni pada metode TBA untuk fraksimetanol 200, 100, 50 ppm adalah 59.81%, 59.02%, 58.96%. Ekstrak air 200,100, 50 ppm adalah 54.65%, 49.01%, 43.09%. Vitamin E 200, 100, 50 ppmadalah 40.91%, 36.48%, 27.15%. Kadar kuersetin yang terdapat dalam sampeladalah 16 mg/100g sampel. Daya hambat dari kuersetin sebagai antioksidan pada50, 100, dan 200 ppm sebesar 87.2%, 89.1%, 92.8%.

ABSTRACT

OLGA MARDISADORA. Identification and antioxidant potential of flavonoidsMahogany Bark (Swietenia macrophylla King). Under the direction of DJAROTS HAMISENO and SYAMSUL FALAH.

Mahogany bark as wood processing industrial waste has not widely usedcompared to other parts of mahogany. This research was conducted to identify theflavonoids from mahogany bark and its role as an antioxidant. Antioxidantactivity of mahogany bark’s extract was measured by using two methods namelydiphenil-1.1-2-picrylhydrazyl (DPPH) method and tiobarbituric acid (TBA)method. Identification of flavonoids (quersetin) was performed by using HPLCand TLC. Antioxidant activity of flavonoids (quersetin) was measured by usingDPPH method.Inhibition activity of mahogany bark’s extract on DPPH methodfor the extraction of methanol, n-hexane, diethyl ether, ethyl acetate, vitamin E(positive control) and water at concentrations of 50 ppm are respectively for81.33%, 12.74%, 23:40%, 65.54 %, 30.42%, and 68.04%. The inhibition activityof mahogany bark’s extract on TBA methods for methanol fraction 200, 100, 50ppm was 59.81%, 59.02%, 58.96%. Extraction of water 200, 100, 50 ppm was54.65%, 49.01%, 43.09%. Vitamin E 200, 100, 50 ppm was 40.91%, 36.48%,27.15%. Kuersetin content in the sample is 16 mg/100g sample. Inhibitionactivity of antioxidants on kuersetin as 50, 100, and 200 ppm for 87.2%, 89.1%,92.8%.

IDENTIFIKASI DAN POTENSI ANTIOKSIDAN FLAVONOIDKULIT KAYU MAHONI ( Swietenia macrophylla King)

OLGA MARDISADORA

SkripsiSebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains padaDepartemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2010

Judul Skripsi : Identifikasi dan Potensi Antioksidan Flavonoid Kulit KayuMahoni (Swietenia macrophylla King)

Nama : Olga MardisadoraNIM : G84051256

DisetujuiKomisi Pembimbing

Dr. Djarot S Hamiseno, M.Sc. Dr. Syamsul F, S.Hut., M.Si. Ketua Anggota

Diketahui

Dr.Ir.I Made Artika, M.App Sc.Ketua Departemen Biokimia

Tanggal lulus :

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas izin-Nya sehinggapenulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Identifikasi dan PotensiAntioksidan Flavonoid Kulit Kayu Mahoni (Swietenia macrophylla King).Penelitian ini didanai oleh program unggulan IPB dibawah payung penelitian Dr.Syamsul F, S.Hut., M.Si dan kawan-kawan. Penelitian ini telah dilaksanakan dariApril hingga Oktober 2009 di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor,Balai Besar Penelitian Pasca Panen dan Pusat Studi Biofarmaka.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Djarot S Hamiseno, M.Sc danDr. Syamsul F, S.Hut., M.Si. selaku pembimbing yang tiada hentinya memberiperhatian lebih kepada penulis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepadadrh.Sulistiyani, M.Sc.,Ph.D., para staf dan laboran Biokimia atas semuabantuannya baik secara langsung maupun tidak langsung.

Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada mama, papa, sertaseluruh keluaraga. atas doa dan kasih sayangnya, kepada kelompok penelitianmahoni (Fitria, Mei, Bakuh, Vijonk dan Ratna), teman-teman biokimia (Vita,Risa, Isti, Arya, Tanti, Mela, Dini, Saipul), teman-teman kosan (Hervi, Cici, Neni,Seri Dina, Elin, Amel, Ela, Eci).

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Februari 2010

Olga Mardisadora

RIWAYAT HIDUPPenulis dilahirkan di Palembang pada tanggal 17 November 1987 dari

ayah Drs. Edward dan ibu Mastura. Penulis merupakan putri pertama dari tigabersaudara.

Pada tahun 2005 penulis lulus SMU Negeri 1 Baturaja dan pada tahunyang sama berhasil lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB(USMI). Penulis memilih mayor Biokimia, Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melakukanpraktik kerja lapangan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Transformasi, BalaiPenelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor dari bulan Juli sampaiAgustus 2008.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR........................................................................................... vi

DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................ vi

PENDAHULUAN ............................................................................................... 1

TINJAUAN PUSTAKASwietenia macrophylla ............................................................................... 2Flavonoid.................................................................................................... 2Radikal Bebas............................................................................................. 3Metode Analisis Aktivitas Antioksidan ..................................................... 4α-tokoferol .................................................................................................. 5Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ............................................... 6Identifikasi Senyawa Flavonoid ................................................................. 6Kromatografi Lapis Tipis ........................................................................... 7

BAHAN DAN METODEBahan dan Alat ........................................................................................... 7Metode Percobaan ...................................................................................... 7

HASIL DAN PEMBAHASANPenentuan Kadar Air .................................................................................. 9Ekstraksi dan Fraksinasi ............................................................................ 9Daya Ekstrak Terhadap Radikal DPPH ..................................................... 10Sistem Oksidasi Asam Linoleat ................................................................. 11Konsentrasi Malondialdehida .................................................................... 12Analisis Flavonoid ..................................................................................... 14Isolasi Flavonoid dan Uji Aktivitas Antioksidan Kuersetin ...................... 14

SIMPULAN DAN SARANSimpulan .................................................................................................... 15

Saran .......................................................................................................... 15

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 15

LAMPIRAN......................................................................................................... 18

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Sweitenia macrophllya...................................................................................... 1

2 Struktur umum flavonoid.................................................................................. 2

3 Struktur kuersetin.............................................................................................. 2

4 Mekanisme pembentukan radikal bebas .......................................................... 3

5 Mekanisme pembentukan radikal bebas dalam peroksidasi lipid..................... 4

6 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil dan 1,1-Difenil-2-picrilhidrazin ........................... 5

7 Daya hambat ekstrak terhadap radikal DPPH .................................................. 11

8 Penentuan waktu inkubasi maksimum ............................................................. 12

9 Daya hambat ekstrak terhadap pembentukan MDA ........................................ 11

10 Hasil analisis sampel dengan HPLC .............................................................. 14

11 Hasil dari KLT .............................................................................................. 14

12 Hasil visualisasi UV-VIS dari KLT .............................................................. 14

13 Daya hambat kuersetin terhadap radikal DPPH ............................................ 15

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Bagan alur penelitian ....................................................................................... 19

2 Ekstraksi dan fraksinasi kulit kayu mahoni ...................................................... 20

3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH............................................... 21

4 Metode pengujian aktivitas antioksidan MDA-TBA........................................ 22

5 Analisis kadar air kulit kayu mahoni ................................................................ 23

6 Hasil ekstraksi kulit kayu mahoni .................................................................... 24

7 Kurva standar TMP .......................................................................................... 25

8 Hasil pengujian aktivitas antioksidasi dengan metode MDA-TBA ................. 26

9 Hasil analisis statistik ....................................................................................... 27

10 Hasil HPLC kulit kayu mahoni fraksi metanol............................................... 28

11 Hasil pengujian aktivitas antioksidan kuersetin.............................................. 29

PENDAHULUAN

Pengobatan tradisional menggunakantumbuh-tumbuhan telah lama dikenal olehmasyarakat Indonesia, jauh sebelum obat-obatan modern dikenal. Berkembangnyaprinsip back to nature meningkatkankecenderungan manusia untukmemanfaatkan bahan alam yang berasaldari tumbuh-tumbuhan sebagai obat bagikesehatannya. Selain itu, krisis ekonomiyang melanda Indonesia beberapa tahunbelakangan ini menyebabkan harga obat-obatan modern tidak terjangkau olehmasyarakat menengah ke bawah.

Swietenia macrophylla atau yang dikenaldengan mahoni ditanam secara luas didaerah tropis dalam program reboisasi danpenghijauan. Tanaman mahoni banyakdigunakan sebagai tanaman naungan.Banyaknya penggunaan mahoni sebagaipohon peneduh di jalan membuat tanamanmahoni banyak terdapat di sekitar kitasehingga pemanfaatan tanaman ini tidakhanya sebagai tanaman peneduh saja tetapimenjadi tanaman yang dapat digunakansebagai salah satu tanaman obat. Selain itu,tanaman mahoni juga telah lamadimanfaatkan dan dikenal dalam pengobatansecara tradisonal. Bagian dari tanamanmahoni yang paling sering digunakansebagai tanaman obat adalah buah dan daunmahoni.

Penemuan buah mahoni sebagai vitamindan obat-obatan pertama kali oleh DoktorLarry Brookes pada tahun 1990. Kandunganflavonoid pada buah mahoni berguna untukmelancarkan peredaran darah, mencegahtersumbatnya saluran darah, mengurangitingkat kolesterol, mengurangi penimbunanlemak pada dinding saluran darah,membantu mengurangi rasa sakit,mengurangi pendarahan dan lebam,bertindak sebagai antioksidan dan berfungsimenyingkirkan radikal bebas. Sedangkansaponin yang berasal dari buah mahoniberguna mencegah penyakit sampar,mengurangi lemak badan, meningkatkansistem kekebalan, mencegah pembekuandarah dan tingkat gula dalam darah, sertamenguatkan fungsi hati (Brookes 1990).

Kulit kayu mahoni adalah bagian daritanaman mahoni yang belum termanfaatkan.Selain itu, kulit kayu mahoni sebagai limbahindustri pengolahan kayu memiliki potensiyang sangat besar. Namun, pemanfaatannyasebagai obat alami belum dilakukan. Olehkarena itu penelitian ini dilakukan dengan

tujuan menentukan aktivitas antioksidanekstrak kulit kayu mahoni danmengidentifikasi adanya kandunganflavonoid kulit kayu mahoni sertamenentukan aktivitas antioksidannya

Penelitian ini dilakukan secara in vitro.Aktivitas antioksidan dari kulit kayu mahonidiukur dengan menggunakan dua metodeyaitu metode 1,1-diphenil-2-picrylhydrazyl(DPPH) dan metode thiobarbituric acid(TBA). Identifikasi flavonoid (kuersetin)dilakukan menggunakan high performanceliquid chromatography (HPLC) dankromatografi lapis tipis (KLT) sedangkanuji antioksidan flavonoid (kuersetin)dilakukan dengan metode DPPH. Penelitianini diharapkan akan meningkatkan inovasiilmu pengetahuan dan teknologi dalampenerapan ilmu biokimia. Selain itu,penelitian ini juga diharapkan dapatmeningkatkan nilai guna kulit kayu mahoniyang merupakan limbah dari industrisehingga lebih bermanfaat secara ekonomidan lingkungan.

TINJAUAN PUSTAKA

Mahoni (Swietenia macrophylla)Mahoni yang diklasifikasikan sebagai

famili Meliaceae mempunyai berbagaispesies, dua spesies yang terkenal adalahSwietenia macrophylla (mahoni daun lebar)(Gambar 1) dan Swietenia mahagoni(mahoni daun sempit). Swieteniamacrophylla memiliki Kingdom: PlantaeSubkingdom: Tracheobionta, Super Divisi:Spermatophyta, Divisi: Magnoliophyta,Kelas: Magnoliopsida, Sub Kelas: Rosidae,Ordo: Sapindales, Famili: Meliaceae,Genus: Swietenia, Spesies: Swieteniamacrophylla (L.) (Cottle 1959).

Gambar 1 Sweitenia macrophllya.

Mahoni berasal dari Amerika Tengahdan Amerika Selatan. Mahoni tumbuh padatipe iklim A sampai D, yaitu daerahbermusim kering atau basah. Ketinggiantempat yang sesuai untuk tanaman iniberkisar antara 0 – 1.000 m dpl. Tinggitanaman ini mencapai 40 m dengan diameterbatang mencapai lebih dari 100 cm . Pohonakan berbuah setelah tanaman berumur 12tahun atau lebih, pada bulan Juli-Agustus.Buah yang masak berwarna cokelat hinggacokelat tua (Nataniella 1997).

Penelitian mengenai kulit kayu mahonitelah dilakukan oleh Falah et al. (2008) yangditekankan pada isolasi senyawa flavonoiddari ekstrak aseton dan aktivitas antioksidanmenggunakan metode DPPH. Hasil yangdiperoleh dari penelitian ini menunjukkankulit kayu mahoni mengandung senyawakatekin, epikatekin, dan krofilanin.

FlavonoidFlavonoida dan isoflavonoida adalah

salah satu golongan senyawa metabolitsekunder yang banyak terdapat padatumbuh-tumbuhan. Kandungan senyawaflavonoida sendiri dalam tanaman sangatrendah, yaitu sekitar 0.25%. Senyawa-senyawa tersebut pada umumnya dalamkeadaan terikat/konjugasi dengan senyawagula (Snyder & Kwon 1987). Senyawaflavonoid terdistribusi secara luas padabagian-bagian tanaman, baik pada akar,batang, daun, maupun buah. Senyawaflavonoida untuk obat mula-muladiperkenalkan oleh seorang Amerikabernama Gyorgy (1936) yang sekaligussebagai pionir (pembuka) penggunaansenyawa tersebut di bidang terapeutik.Gyorgy menemukan senyawa yang disebutsebagai senyawa "bioflavonoids" atauvitamin P yang dinyatakan sebagai anti-hemorrhage (pendarahan).

Senyawa flavonoida adalah kelompoksenyawa fenol terbesar yang ditemukan dialam. Senyawa ini merupakan zat warnamerah, ungu, biru dan kuning yangditemukan dalam tumbuh-tumbuhan.Golongan flavonoid memiliki kerangkakarbon yang terdiri atas dua cincin benzenatersubtitusi yang disambungkan oleh rantaialifatik tiga karbon (Gambar 2).

Gambar 2 Struktur umum flavonoid(Robinson 1995).

Sejumlah tanaman obat yangmengandung flavonoid telah dilaporkanmemiliki aktivitas antioksidan, antibakteri,antivirus, antiradang, antialergi danantikanker (Miller 1996). Efek antioksidansenyawa ini disebabkan oleh penangkapanradikal bebas melalui donor atom hidrogendari gugus fungsi hidroksil flavonoid.Beberapa penyakit seperti asteroklorosis,kanker, diabetes, parkinson, alzheimer, danpenurunan kekebalan tubuh telah diketahuidipengaruhi oleh radikal bebas dalam tubuhmanusia (Amic et al. 2000).

Pengelompokan flavonoid berdasarkanpada cincin heterosiklik-oksigen tambahandan gugus hidroksil tersebar menurut polayang berlainan (Robinson 1995). Golonganterbesar flavonoid memiliki cincin piranyang menghubungkan rantai tiga-karbondengan salah satu cincin benzena. Padaumumnya, flavonoid terikat pada gulasebagai glikosida dan aglikon flavonoid,dapat pula berada dalam satu tumbuhandalam beberapa bentuk kombinasi glikosida(Harbone 1987).

Jenis utama flavonoid adalahantosianidin, flavonol, flavon, flavonons,dan iso flavon ( Spencer et al. 2003).Dibandingkan dengan jenis flavonid lain,jenis flavonol dan flavons merupakan duadari jenis flavonoid yang paling banyakterdapat dalam tanaman sayur-sayuran.Flavonol terdiri atas kuersetin yangumumnya merupakan komponen terbanyakdalam tanaman sedangkan flavon yangterdiri atas lutelin dan apigenin, hanyaditemukan pada bagian pangan tertentu (Lee2000).

Flavonoid memiliki efek biologis dalamsistem sel mamalia yang berperan dalamkesehatan manusia. Beberapa flavonoid,terutama kuersetin meningkatkankemungkinan untuk mengurangi resikokanker, penyakit jantung, dan stroke padamanusia. Senyawa kuersetin (Gambar 3)merupakan golongan flavonol yang palingbanyak terdapat dalam tanaman danmerupakan senyawa yang paling aktifdibandingkan golongan flavonol ( Aviram& Furkham 2003).

Gambar 3 Struktur Kuersetin(Robinson 1995).

Banyak tanaman obat menunjukkankhasiatnya yang seiring dengan tingginyakandungan kuersetin. Kuersetin juga telahterbukti memiliki aktivitas sebagai antiperadangan, karena langsung menghambatpenyebab utama dari peradangan tersebut.Kuersetin juga memiliki kemampuansebagai antitumor. Selain itu, kuersetin jugamemiliki pengaruh yang positif dalammembantu mencegah kanker, gangguanjantung, katarak, dan gangguan pernafasan,seperti bronkitis dan asma. Kuersetinmampu menghambat oksidasi LDL dengancara mengkelat ion tembaga, yang dapatmenginduksi LDL ( Aviran & Furkham2003).

Radikal Bebas, Lipid Peroksida, danAntioksidan

Radikal bebas merupakan suatu atomatau molekul yang memiliki satu atau lebihelektron yang tidak berpasangan pada orbitalterluarnya (Mimić-Oka et al 1999). Adanyaelektron bebas yang tidak berpasanganmengakibatkan radikal bebas bersifat sangatreaktif dan tidak stabil. Untuk menstabilkandiri, radikal bebas cenderung bereaksidengan senyawa lain untuk mendapatkanpasangan elektron. Beberapa radikal bebasyang terdapat di dalam tubuh antara lainradikal hidroksil (OH*), radikal peroksillipid (LOO*), radikal oksida nitrit (NO*),dan radikal supeoksida (O2

*) (Langseth1995).

Radikal bebas dapat dihasilkan dari hasilmetabolisme tubuh (endogenous) misalnya,sekitar 5 persen dari oksigen pernafasanakan diubah menjadi radikal bebas. Selainitu faktor eksternal (eksogenous) juga dapatmenghasilkan radikal bebas, seperti asaprokok, hasil penyinaran ultra violet, zatkimiawi dalam makanan maupun darisenyawa-senyawa polutan lain. Adanyaatom atau molekul radikal bebas terjadimelalui sederetan mekanisme reaksi(Gambar 4). Reaksi tahap pertama adalahpembentukan radikal bebas awal (inisiasi).Tahap kedua adalah penambatan atauterbentuknya radikal baru (propagasi).Reaksi ini terjadi secara terus meneruskarena menghasilkan radikal bebas lain yangmenyebabkan terjadinya proses oksidasilebih lanjut. Tahap terakhir adalah terminasi,yaitu penghilangan atau pengubahan radikalbebas menjadi molekul stabil dan tak reaktif.Terminasi terjadi bila ada reaksi antararadikal bebas itu sendiri (Hart 1983).

Gambar 4 Mekanisme pembentukan radikalbebas (Hart 2003).

Beberapa kerusakan yang dapat timbulakibat serangan radikal bebas antara lainkerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid,kerusakan membran sel, terutama penyusunmembran sel berupa asam lemak tidak jenuhyang merupakan bagian dari fosfolipid sertaprotein, menimbulkan autoimun, danmenyebabkan penyakit degeneratif. Penyakityang disebabkan oleh radikal bebasumumnya bersifat kronis, yaitu dibutuhkanwaktu bertahun-tahun untuk penyakittersebut menjadi nyata (terjadi akumulasidalam tubuh). Contoh penyakit yang seringdihubungkan dengan radikal bebas adalahpenyakit jantung koroner dan kanker. Akantetapi, keberadaan radikal bebas tidakselamanya berbahaya bagi tubuh. Misalnya,radikal bebas berperan dalam pencegahanpenyakit yang disebabkan mikroba melaluisel-sel darah khusus (Tuminah 2000).

Salah satu molekul yang sensitifterhadap serangan radikal bebas adalah lipid.Reaksi antara lipid dan radikal bebas akanmenghasilkan lipid peroksida. Peroksidasilipid terjadi akibat serangan radikal bebasterhadap asam lemak tak jenuh majemuk(PUFA) yang sedikitnya mengandung tigaikatan rangkap (Halliwel dan Gutteridge1985, diacu dalam Wiseman et al 2005).Reaksi radikal bebas terhadap PUFA akanmenghasilkan peroksil lipid (ROO*) yangdapat menghasilkan lipid peroksida (Gambar5). Jika radikal peroksil lipid bereaksidengan PUFA yang lain dapat membentuklipid peroksida (ROOH) dan lipid bebas (R*)yang baru. Lipid peroksida terbentuk akibathilangnya sebuah atom hidrogen yangdiakibatkan serangan radikal peroksil lipid.Reaksi ini berlangsung secara berantai danterus menerus, sebab reaksi inimenghasilkan radikal lipid bebas (R*) yanglain (Murray 2003). Jumlah lipid peroksidadalam tubuh tidak boleh melebihi kadarnormalnya yaitu 4 mmol/mL (Yagi 1994).Seiring bertambahnya usia, kadar peroksidalipid dalam tubuh akan semakin meningkat.

Gambar 5 Mekanisme pembentukan radikalbebas dalam peroksidasi lipid(Murray 2003).

Antioksidan merupakan senyawa yangmampu menetralisir atau menstabilkanradikal bebas dengan cara melengkapikekurangan elektron pada radikal bebastersebut. Substansi ini mampu mencegahterjadinya reaksi berantai dari pembentukanradikal bebas yang dapat menimbulkan stresoksidatif (ketidakseimbangan antaraprooksidan dan antioksidan) (Kikuzaki &Nakatani 1993). Terdapat tiga macam,mekanisme kerja antioksidan pada radikalbebas, yaitu (1) antioksidan primer yangmampu mengurangi pembentukan radikalbebas baru dengan cara memutus reaksiberantai dan mengubahnya menjadi produkyang lebih stabil. Contohnya adalahsuperoskida dismutase (SOD), glutationperoksidase, dan katalase yang dapatmengubah radikal superoksida menjadimolekul air, (2) Antioksidan sekunderberperan mengikat radikal bebas danmencegah amplifikasi senyawa radikal.Beberapa contohnya adalah vitamin C,vitamin B, vitamin E, betakaroten dansenyawa fitokimia, (3) Antioksidan tersierberperan dalam mekanisme biomolekuler,seperti memperbaiki kerusakan sel danjaringan yang disebabkan radikal bebas(Kartikawati 1999).

Menurut Winarno (1997), antioksidandiklasifikasikan menjadi dua jenis yaitusintetik dan alami. Antioksidan sintetikmerupakan antioksidan hasil sintesis reaksikimia. Beberapa antioksidan sintetik yangsering digunakan butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene (BHT),propilgalat (PG), nordihidroguaricetic Acid(NDGA). Antioksidan sintetik tersebutadalah senyawa-senyawa fenol yangbiasanya beracun, sedangkan antioksidanalami diperoleh dari hasil ekstraksi bahan

alami. Contohnya antara lain tokoferol,sesamol, gosipol, dan asam askorbat.

Berdasarkan sumbernya, antioksidanterbagi menjadi antioksidan endogen danantioksidan eksogen. Antioksidan endogenmerupakan antioksidan yang dapatdiproduksi oleh tubuh sendiri atau secaraalami terdapat di dalam tubuh. Beberapaenzim dalam tubuh yang merupakanantioksidan endogen adalah superoksidadismutase, glutation peroksidase, biliverdinreduktase, katalase, dan tioredoksinreduktase. Contoh antioksidan endogen lainyang bukan enzim adalah glutation dankoenzim-Q. Antioksidan eksogen adalahantioksidan yang diperoleh dari luar tubuhatau dari asupan makanan, misalnya vitaminC, vitamin E, dan senyawa fitokimia padatanaman, yaitu flavonoid, senyawa fenol,terpenoid, alkaloid, saponin, dan tanin(Atmosukarto 2003).

Metode Analisis Aktivitas AntioksidasiAktivitas antioksidasi dapat diuji secara

langsung maupun tidak langsung. Pengujiansecara langsung didasarkan padapengukuran produk-produk utama darioksidasi lipid, yang umumnya adalahhidroperoksida dan produk sekunder sepertialdehid. Pengujian aktivitas antioksidansecara langsung dapat dilakukan denganbeberapa metode diantaranya adalah metodeoksigen aktif (active oxygen methods(AOM)), metode feritiosianat (FTC), metodetiobarbituric acid (TBA), uji Schall, ujimasa simpan, dan uji rancimat (Adawiyah etal 2001).

Pengujian secara tidak langsungdidasarkan pada pengukuran selain produkutama atau sekunder dari oksidasi lipid,misalnya jumlah oksigen yang diperlukanuntuk oksidasi. Beberapa pengujian aktivitasantioksidasi secara tidak langsung, yaitu ujiwadah oksigen (Oxygen Bomb Test), sistememulsi β-karoten-linoleat, penyemprotanlarutan β-karoten, dan metode penimbangan(Adawiyah et al 2001). Selain metodetersebut, ada pula beberapa metode lainnyaseperti bilangan ansindin, uji bilanganperoksida, uji kreis, dan diena terkonjugasi(Adawiyah et al 2001).

Metode yang digunakan untukmenentukan aktivitas oksidasi padapenelitian ini adalah metode TBA danDPPH. Menurut Kikuzaki dan Nakatani(1993), prinsip dari metode TBA ini adalahproses autooksidasi dari asam linoleat yangakan menghasilkan malondialdehida (MDA)

yang dengan adanya asam 2-tiobarbituratakan membentuk kompleks MDA-TBAyang berwarna merah muda yang dapatdiukur serapannya pada λ 532 nm. Secaraspektrofotometri, uji TBA digunakan untukmengukur jumlah MDA dalam bentuktiobarbituric acid reactive substsances(TBARS). Reaksi TBA diketahui sangatsensitif terhadap peroksida lipid. Meskidemikian produk oksidasi lipid lainnyaseperti 2-alkenals, 2,4-alkenadials, dan 2,4-hidroksialkenals serta senyawa-senyawa nonlipid lainnya seperti gula, asam amino, urea,biliverdin, glioksal, dan furfural aldehiddapat bereaksi dengan TBA membentukkompleks berwarna yang dapat terukur padapanjang gelombang yang sama (Schultz1963; Wong 1995)

Sebelum uji potensi antioksidasi denganmetode TBA, dilakukan pengukuranhidroperoksida yang merupakan produkprimer oksidasi asam linoleat denganmetode diena terkonjugasi. Pengukuranhidroperoksida bertujuan untuk menentukanwaktu inkubasi maksimum. Penentuanwaktu inkubasi maksimum asam linoleatbertujuan untuk mengetahui lama yangdiperlukan dalam menentukan dayaantioksidasi sampel. Tahapan awalnya(inisiasi) asam linoleat akan dioksidasimenjadi diena terkonjugasi. Kemudian padatahap berikutnya (propagasi), kadar dienaterkonjugasinya terus meningkat dan akanmencapai kadar yang maksimum. Dienaterkonjugasi tersebut dapat ditentukanintensitas penyerapannya pada λ 234 nm(Rossel 1983, diacu dalam Tensiska 2001).Selanjutnya diena terkonjugasi akanmembentuk hidroperoksida dan akanmengalami dekomposisi menjadi MDA.Metoda diena terkonjugasi digunakankarena metode ini lebih cepat, lebihsederhana, dan membutuhkan sampel dalamjumlah yang cukup kecil dibandingkandengan beberapa metode yang lain.

Metode ke dua yang digunakan adalahmetode aktivitas antiradikal bebas DPPHyang merupakan metode untuk menapisaktivitas antioksidan bahan alam (Santosa etal. 1998). Pengujian aktivitas antioksidandilakukan dengan menggunakan metodeperedaman radikal bebas DPPH yangmendasarkan prinsip kerjanya pada sampel(mengandung senyawa bersifat antioksidan)yang dapat meredam radikal bebas (DPPH).(Hatano 1988)

Senyawa antioksidan akan bereaksidengan radikal DPPH melalui pendonoran

atom hidrogen (Gambar 6) yangmenyebabkan terjadinya peluruhan warnadari warna ungu menjadi kuning yangdiukur pada panjang gelombang 517 nm(Blois 1958). Selain itu metode ini lebihcepat, lebih sederhana, dan membutuhkansampel dalam jumlah yang cukup kecildibandingkan dengan beberapa metode yanglain. Perbedaan antara metode DPPH danMDA-TBA terletak pada sensitivitasterhadap kerja antioksidan. Pelarut yangdigunakan pada metode DPPH adalahmetanol sehingga sampel yang larut metanolsangat sensitif dengan metode ini ( Huang etal. 2008). Sedangkan menurut Yagi (1994)pereaksi TBA mempunyai sensitivitas yangtinggi terhadap peroksida lipid yangdijadikan parameter terjadinya oksidasidalam tubuh.

O2N

N-N(C6H5)2

NO2

NO2

+ AH

O2N

N-N(C6H5)2

NO2

NO2

H

+ A

Gambar 6 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil dan1,1-Difenil-2-picrilhidrazin.

α-tokoferolVitamin E merupakan antioksidan yang

tergolong senyawa fenolik yang larut lemakserta terletak di membran eritosit dan plasmalipoprotein. Sebagai antioksidan dalamtubuh, vitamin E bertindak sebagaiscavenger (penangkap) radikal-radikal bebasyang masuk ke dalam tubuh atau terbentukdi dalam tubuh dari proses metabolismenormal. Vitamin E bertindak sebagai donorion hidrogen dan dapat mengubah radikalperoksil (hasil peroksidasi lipid) menjadiradikal tokoferol yang kurang reaktif danrelatif stabil sehingga tidak mampu merusakrantai asam lemak (Widjaja 1997).

Vitamin E terdiri atas beberapa macamdiantaranya adalah α-tokoferol, β-tokoferol,δ-tokoferol, dan γ-tokoferol. Komponenvitamin E yang paling banyak ditemukanadalah α-tokoferol yang memiliki cincinaromatik tersubtitusi dan rantai panjangisoprenoid sebagai rantai samping(Lehninger 1982). Peranan vitamin E dalamsel adalah dengan cara mengikat radikalbebas. Dalam jaringan, vitamin E menekanterjadinya asam lemak tidak jenuh yangterdapat pada membran, dengan demikian

mampu menjaga atau mempertahankanfungsi membran (Turkoglu et al. 2006).

Kromatografi Cair Kinerja TinggiAnalisis kimia dengan metode

kromatografi didasarkan pada pemisahankomponen yang terpartisi di antara dua fasedalam suatu kesetimbangan dinamis danmengalir. Proses ini dilakukan denganmenggerakan suatu fase secara mekanis(fase gerak) relative terhadap fase lainnya.

Menurut Gritter et al. (1991) secara teoripemisahan kromatografi yang paling baikakan diperoleh jika fase diam mempunyailuas permukaan sebesar-besarnya, sehinggamemastikan kesetimbangan yang baikantara fase. Persyaratan kedua agarpemisahan baik adalah fase gerak harusbergerak dengan cepat secara difusi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaanfase diam yang luas, pada sebagian besarsistem kromatografi digunakan penjerapatau penyangga berupa serbuk halus. Untukmemaksa fase gerak bergerak lebih cepatmelalui fase diam yang terbagi pada serbukhalus harus digunakan tekanan tinggi.Dengan dipenuhinya kedua persyaratantersebut, diperoleh teknik kromatografi cairyang paling efektif yakni kromatografi cairkinerja tinggi (KCKT) atau highperformance liquid chromatography(HPLC). Jadi pada HPLC fase gerakdialirkan dengan cepat dan hasilnya dideteksi dengan instrumen.

Komponen utama dari sistem HPLCadalah pompa (tekanan tetap dan volumetetap), penginjeksi, kolom (eksternal daninternal), detektor, dan rekorder atau sistemdata yang terintegrasi ( Rounds & Gregor2003). Berbagai parameter yang akanmempengaruhi sistem kerja pada HPLCanatara lain diameter dari kolom HPLC,ukuran partikel, ukuran lubang pada fasediam, dan tekanan pompa.

Terdapat lima tipe HPLC yaitu normalion-exchange chromatography, size-exclusion chromatography, affinitychromatography, phase chromatography,dan reversed phase chromatography.(Rounds & Gregor 2003). Pada penelitianini, tipe HPLC yang digunakan adalahreversed phase chromatography (RP-HPLC). Fase diam dari HPLC jenis iniadalah senyawa nonpolar, sedangkan fasegeraknya polar. Oleh karena hal tersebutlahmaka komponen yang akan keluar lebih duluadalah komponen yang polar dibandingkanyang nonpolar.

Lebih dari 70% teknik pemisahandengan metode HPLC menggunakan tipereversed phase. Beberapa contoh teknikpemisahan yang menggunakan metode RP-HPLC adalah analisis protein dari tanaman,protein dari biji-bijian, analisis vitamin larutair dan larut lemak, pemisahan karbohidrat,dan penentuan unsur-unsur pokok dariminuman ringan. Reversed phase HPLCdengan metode deteksi yang sangatbervariasi, digunakan untuk menganalislemak (Rounds & Gregor 2003).

Antioksidan, seperti butylatedhydroxylanisole (BHA) dan butylatedhydroxytoluene (BHT), dapat diekstrak daribahan pangan kering dan dianalisis denganmenggunakkan detektor ultra violet (UV)dan flouresens secara bersamaan. Bahanpangan basah, pigmen (seperti klorofil,karotenoid, dan antosianin), dan komponenfenolik seperti vanili), dapat pula dianalisisdengan menggunakan metode RP-HPLC(Rounds & Gregor 2003)

Kolom reversed phase chromatographylebih sulit untuk rusak dibandingkan dengankolom silika normal. Hal ini dikarenakankolom RP-HPLC terdiri atas alkil turunansilika dan tidak pernah digunakan denganlarutan basa (karena larutan basa akanmenghancurkan ikatan silika). Kolom RP-HPLC dapat digunakan dengan larutan asamtetapi tidak boleh kontak terlalu lama karenaasam dapat menimbulkan korosi pada logamyang ada dalam peralatan HPLC.Kandungan logam pada kolom HPLC harusdijaga agar tetap rendah supaya dapatmemberikan hasil terbaik pada pemisahankomponen. Salah satu cara untukmengetahui kandungan logam di dalamkolom HPLC adalah menginjeksikancampuran dari 2,2’- dan 4,4’-bipiridin. Bilaterdapat ion logam di permukaan silika,maka senyawa 2,2’-bipiridin akan mengkelatlogam tersebut dan peak dari senyawa yangakan diidentifikasi menjadi tidak teratursehingga dapat memberikan hasil yang tidaksesuai.

Identifikasi Senyawa FlavonoidBerbagai penelitian telah dilakukan

untuk mendeteksi komponen fenolik dalambahan pangan dengan metode HPLC.Komponen fenolik merupakan senyawaaromatik, oleh karena itu senyawa tesebutakan memberikan penyerapan yang baikpada panjang gelombang sinar UV.Flavonoid yang merupakan bagian darisenyawa fenolik, memiliki serapan pada

panjang gelombang 240 dan 270 nm, danantara 320 dan 380 nm. Untuk mendeteksikomponen fenolik, detektor yang digunakanpada komponen HPLC adalah detektor UVatau UV-Vis ( Lee 2000).

Analisis flavonoid pada sayuran sepertiyang dikemukan Hertog et al. (1992) banyakdiadopsi oleh para peneliti lain (Lee 2000).Identifikasi flavonoid pada sayurandilakukan dengan menggunakan fase gerak25% asetonitril dan buffer fosfat 0.025M,laju aliran adalah 0.9 ml/menit. Sampel yangakan diidentifikasi akan melewati kolomNova_pak C18, yang akan memiliki dimensi(150 x 3,9-mm ID). Detektor yangdigunakan yaitu Linear Model 204 UV-Visdetektor (Hertog et al. 1992).

Menurut Macrae (1998) keuntunganutama dari HPLC adalah kemampuannyauntuk menangkap komponen denganstabilitas panas yang terbatas ataupun yangbersifat volatile. HPLC adalah metode yangsangat selektif, dan memiliki tingkatotomatisasi yang tinggi, sehingga lebihsederhana dalam pengoperasian. Di sampingitu, HPLC banyak digunakan untuk analisiskarena kemudahan injeksi, deteksi danpengolahan data serta dapat digunakan untukberbagai macam sampel seperti sampelcairan, padatan yang dilarutkan, maupunsampel yang labil terhadap pemanasan.Modern HPLC telah banyak diaplikasikanseperti pemisahan, identifikasi, pemurnian,dan penghitungan komponen yangbervariasi.

Menurut Adamoson et al. (1999) HPLCmerupakan metode yang efektif untukmendeteksi dan menghitung komponenfenol dan metode ini telah digunakan secaraluas. HPLC telah digunakan dalammenghitung prosianidin dalam kakao dancoklat. Dalam penelitian lain Mark et al.(2005) mengungkapkan bahwa HPLCmerupakan metode yang telah banyakdigunakan untuk analisis kuantitatif senyawapolifenol seperti flavonol danproantosianidin.

Kromatografi Lapis TipisKromatografi lapis tipis (KLT) pertama

kali diperkenalkan oleh Stahl pada tahun1956 dengan cara menambahkan 2-5%perekat CaSO4 ke dalam silika gel kemudianmerekatkan silika gel tersebut pada suatuplat gelas (Pomeranz & Meloan 1994).Pomeranz dan Meloan (1994) menyatakanbeberapa keuntungan KLT antara lainmudah digunakan, sederhana, tidak

memerlukan keahlian khusus dan banyakparameter percobaan yang mudahdivariasikan untuk mendapatkan efek-efekpemisahan.

Prinsip utama KLT adalah adsorben,pengembangan dan deteksi (Heftman 1976).Sedangkan menurut Ault (1976) teknik-teknik KLT yang penting meliputi persiapanplat, pengembangan dan visualisasi. Christie(1982) menyatakan bahwa silika gel adalahadsorben yang paling umum digunakanuntuk berbagai tujuan dan biasanyamengandung kalsium sulfat yang berfungsisebagai pengikat untuk meningkatkan dayaadhesi lapisan pada plat. Pengembangandilakukan dalam suatu bejana yang telahdijenuhkan dengan pelarut dan kejenuhandipertahankan selama pengembangan.Larutan pengembangan dapat berupa satuatau lebih campuran pelarut yang ditentukanlewat percobaan (Ault 1976). Tahapselanjutnya setelah pengembangan adalahdeteksi atau visualisasi. Menurut Ault(1976) jika senyawa yang terdapat dalamsampel sudah berwarna maka dapat diamatisecara langsung, tetapi jika tidak berwarnamaka pengamatan dapat dilakukanmenggunakan sinar UV, uap iodium ataupenyemprotan dengan pereaksi khusus yangakan bereaksi dengan komponen dalamsampel.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan AlatBahan-bahan yang digunakan adalah

kulit kayu mahoni. Bahan untuk ekstraksi:aseton, n-heksana, dietil eter, etil asetat,kertas saring, aquades. Pengujian aktivitasantioksidan: buffer fosfat, asam linoleat,etanol 99.8%, TBA, vitamin-E (α-tokoferol),trichloroacetic (TCA), asam asetat, 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP), 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES),DPPH. Identifikasi flavonoid: kuersetin,asetonitril, KH2PO4, HCL, Na2CO3, danetanol 95%, metanol.

Alat yang digunakan adalah alat gelas,neraca analitik, corong, waterbath, corongpisah, rotaevapor, sentrifus, danspektrofotometri UV-VIS, HPLC danklinomat. Alat lain yang digunakan adalahbotol gelap, vortex, kuvet, pipet Mohr, pipetmikro, dan cawan porselin, pipet tetes.

MetodeTahap penelitian ini meliputi analisis

kadar air, ekstraksi, pengkuran antioksidan,

identifikasi senyawa flavonoid (kuersetin)menggunakan HPLC, isolasi senyawamenggunakan KLT dan uji antioksidansenyawa hasil pemurnian (Lampiran 1).

Analisis Kadar Air (Harjadi 1993 )Cawan porselin dipanaskan pada oven

dengan suhu 100°C selama 30 menit,kemudian ditimbang. Hal ini dilakukansampai berat cawan porselin konstan.Selanjutnya 2 gram sampel dimasukan kedalam cawan porselin dan dipanaskan padaoven dengan suhu 100°C. Hal ini jugadilakukan sampai berat sampel menjadikonstan. Besarnya kadar air dihitung dalampersen dengan cara:((Berat sampel awal- berat sampel akhir)) :berat sampel awal ) x 100%

Ekstraksi dan Fraksinasi dengan PelarutAseton, Metanol, n-heksana, Dietil Eter,Etil Asetat)

Serbuk kayu mahoni (40-80 mesh, 3000g berat kering) diekstraksi tiga kali denganaseton ( masing-masing sebanyak 3 liter),pada suhu ruang selama 48 jam untuk setiapekstraksi. Hasil ekstraksi dirotaevapor danrendemennya dilarutkan kembali denganmetanol. Ekstrak aseton hasil rotaevaporasidiekstrak kembali dengan 200 ml aseton danlarutan disuspensikan oleh penambahan 50ml air dan difraksinasi dengan n-heksana150 ml, dipisahkan dengan corong pisahfraksi yang mengandung n-heksanadirotavapor. Fraksi sisanya difraksinasikembali dengan dietil eter 150 ml,dipisahkan dengan corong pisah dan fraksiyang mengadung dietil eter dirotavapor.Fraksi sisanya difraksinasi kembali denganetilasetat 150 ml, dipisahkan dengan corongpisah dan fraksi yang mengandung etil asetatdirotavapor (Falah et al 2008) (Lampiran2).

Ekstraksi dengan Pelarut AirSerbuk kulit kayu ditimbang dan

ditambah dengan air (perbandingan 1 g : 10ml air). Kemudian dipanaskan pada suhu100°C selama kurang lebih 4 jam. Ekstrakyang diperoleh disaring dan filtratnyadiuapkan dengan rotaevapor pada suhu 60°C(Harjadi 1993).

Aktivitas Antioksidan dengan MetodeDPPH (Blois 1958)

Aktivitas antioksidan dari fraksi diujidengan metode DPPH (Blois 1958) yangdimodifikasi. Sampel dilarutkan ke dalam

metanol sehingga konsentrasi larutanmenjadi 50 ppm. Larutan dari sampel yangakan diuji (0, 30, 60, 90, 120, 150 µL)ditambahkan ke dalam campuran 0.4 mMlarutan DPPH, 20% larutan MeOH danlarutan buffer 0.2 M MES (1mL:1mL:1mL).Campuran dihomogenasikan dengan vortexselama 20 menit dan diukur absorbansinyadengan spektrofotometri pada panjanggelombang 517 nm (Lampiran 3). Pengujianini juga dilakukan terhadap blanko (larutanDPPH yang tidak mengandung bahan uji)serta kontrol positif α-tokoferol. Aktivitaspenangkap radikal DPPH (%) dihitungdengan rumus:(A blanko-A sampel) : Ablanko x 100 %.

Penentuan Waktu Inkubasi Maksimum(Esterbauer et al.1989, diacu dalam Taher2003)

Penentuan waktu inkubasi maksimumdilakukan dengan menggunakan 2 mL bufferfosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50mM dalam etanol 99.8% dan 1 mL airbebas ion diletakkan ke dalam botol gelapyang berulir, kemudian campuran diinkubasipada suhu 40°C. Lama inkubasi ditentukansetelah tercapainya absorban maksimum.Campuran sampel tersebut diambil 50µL kedalam 6 mL etanol 75%, kemudianabsorbansi diena terkonjugasi sampel diukurlangsung menggunakan spektofotometrisinar UV pada panjang gelombang 234 nm.Sampel diukur setiap hari sampai tercapaiabsorbansi maksimum.

Analisis Konsentrasi Malondialdehida(MDA) dengan Metode TBA (Kikuzaki1993)

Campuran sampel yang dibuat terdiriatas 2 mL buffer fosfat 0.1M pH 7, 2 mLasam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%dan 1 mL larutan uji. Campuran kontroltanpa perlakuan dibuat sama seperticampuran sampel tetapi 1 mL larutan ujidiganti dengan 1 mL air bebas ion.Campuran pembanding yang dibuat terdiriatas 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7,2 mLasam linoleat 50mM dalam etanol 99.8%yang mengandung α-tokoferol (vitamin E200 ppm), dan 1 mL air bebas ion.

Semua campuran tersebut diinkubasidalam penangas air yang bersuhu 40°Cdengan lama inkubasi 2 hari setelah waktuinkubasi maksimum. Masing-masingcampuran reaksi diambil 1 mL laluditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mLlarutan TBA 1% (b/v) dalam asam asetat

50%. Kemudian campuran reaksi tersebutditempatkan pada penangas air yang bersuhu100°C selama 10 menit. Setelah itudidinginkan dan dilakukan sentrifugasidengan kecepatan 3000 rpm selama 15menit, selanjutnya diukur absorbansinyadengan spektrofotometeri pada panjanggelombang 532 nm.

Sebagai kurva standar, larutan stokpereaksi 1, 1, 3, 3, - tetrametoksipropana(TMP) konsentrasi 6 M diencerkan menjadi60 µM kemudian diencerkan kembalimenjadi 3, 6, 9, 12 dan15µM. masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 1 mLlalu ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mLTBA 1% (b/v) dalam asam asetat 50% (v/v).kemudian semua tabung diinkubasi padasuhu 100°C selama 10 menit dandidinginkan pada suhu kamar. Setelahdingin dilakukan sentrifugasi dengankecepatan 3000 rpm selama 15 menitselanjutnya diukur absorbansinya denganspektrofotometri pada panjang gelombang532 nm (Lampiran 4).

Analisis Flavonoid dengan HPLC (Hertoget al 1992)

Identifikasi flavonoid pada penelitian inidilakukan dengan menggunakan fase gerak25% acetonitril dan buffer fosfat 0.025M.Laju alirnya sebesar 0.9 ml/menit. Sampelyang akan diidentifikasi akan melewatikolom Nova_pak C18, yang memilikidimensi (150 x 3,9-mm ID). Detektor yangdigunakan yaitu linear model 204 UV-Visdetektor (Hertog et al 1992).

Standar kuersetin yang telah disaringdengan syringe filter 0.45 µm, diinjeksikanke dalam kolom HPLC. Selanjutnya ekstraksampel (fraksi yang memiliki dayaantioksidan tertinggi) juga disaring dengansyringe filter 0.45 µm dan diinjeksikan kedalam kolom. Kemudian hasil darikromatogram sampel dibandingkan dengankromatogram standar ( kuersetin). Penentuankomponen yang terdapat pada sampel dilihatberdasarkan waktu retensi masing-masingstandar.

Isolasi Senyawa Flavonoid (kuersetin)(Osawa dan Namiki 1981)

Isolasi senyawa flavonoid ekstrak kulitkayu mahoni dilakukan dengankromatografi lapis tipis silika F254

menggunakan pelarut metanol. Standarkuersetin dan sampel diinjeksikan dilempengan silka dengan menggunakanklinomat. Lempengan silka dimasukkan ke

dalam bejana KLT yang berisi metanoljenuh. Selanjutnya sampel akan terpisahmenjadi beberapa fraksi. Fraksi yangdiperoleh divisualisasi dibawah sinar lampuUV (panjang gelombang 254-366).Komponen-komponen yang terpisah padalapis tipis khususnya yang Rf-nya samadengan standar dikerok dan dilarutkan dalam2 mL etanol, diendapkan dan dipisahkanuntuk pemurnian dari komponen penyusunplat KLT.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penentuan Kadar AirKandungan air dalam sampel kulit kayu

mahoni sebesar 7.5%. Hasil perhitungankadar air dapat dilihat pada Lampiran 5.Penentuan kadar air berguna untukmenyatakan kandungan zat dalam tumbuhansebagai persen bahan kering dan sebagaifaktor koreksi suatu sampel jika penelitiandilakukan pada sampel yang memilikilingkungan agrobiofisik yang berbeda.Selain itu, juga untuk mengetahui ketahanansuatu bahan dalam penyimpanan (Harjadi1993). Sampel yang baik disimpan dalamjangka panjang adalah sampel yangmemiliki kadar air kurang dari 10%. Olehkarena itu kulit kayu mahoni ini dapatdisimpan dalam jangka waktu panjang.Selain itu penentuan kadar air juga berfungsiuntuk memperkirakan jumlah bahan yangdibutuhkan jika ingin mengekstraksi bahanlangsung dalam keadaan basah dan sebagaikoreksi rendemen.

Ekstraksi dan FraksinasiEkstraksi yang digunakan pada

penelitian ini adalah metode rebusan danmaserasi. Metode rebusan dilakukan denganmerebus serbuk kulit kayu mahoni dan airselama 4 jam. Hal ini mengikuti metodeyang digunakan oleh Harjadi (1993).Pemilihan metode rebusan didasarkan padakebiasaan masyarakat yang seringmengkonsumsi bahan herbal dengan caramenyeduh dan melarutkannya dalam airselain itu metode rebusan merupakanmetode yang murah dan praktis sehinggadapat dilakukan oleh masyarakat umum.Metode kedua adalah maserasi dengan caramerendam sampel dalam pelarut tertentu.Maserasi merupakan metode yang sederhanakarena tidak menggunakan pemanasansehingga dapat mencegah rusaknya senyawametabolit sekunder yang tidak tahan

terhadap suhu yang tinggi. Proses maserasidengan menggunakan aseton, metanol, n-heksana, dietil eter, etil asetat mengacu padapenelitian yang telah dilakukan Falah et al(2008).

Rendemen yang diperoleh dari ekstraksiditunjukkan pada Tabel 1. Sedangkan padapenelitian Falah et al (2008) rendemen yangdihasilkan dari ekstraksi dengan aseton,ekstaksi dengan metanol, fraksinasi n-heksana, fraksinasi dietil eter, dan fraksinasietil asetat adalah masing-masing sebesar

19.93% dan 6.96%. 0.28%, 1.16%, 3.10%.Pada penelitian ini jumlah ekstrak yang

dihasilkan lebih kecil daripada yangdilakukan Falah et al (2008) dikarenakanpada penelitian ini kulit kayu mahoni yangdigunakan berasal dari tanaman mahoniyang umurnya lebih muda (15 tahun) jikadibandingkan yang digunakan Falah et al(2008) ( 30 tahun). Selain itu lingkunganagrobiofisik tanaman yang digunakan jugaberbeda sehingga mempengaruhi kadarsenyawa metabolit sekunder tanaman.Menurut Nurcholis (2008) produksimetabolit sekunder pada suatu tanamandipengaruhi oleh beberapa faktordiantaranya umur tanaman dan interaksilingkungan. Hal ini juga sesuai denganHanan (1999) yang menyatakan bahwakandungan senyawa dalam suatu tanamanyang sama bisa berbeda karena adanyapengaruh iklim, keadaan tanah, sinarmatahari, dan cara pengolahannya.

Pemilihan pelarut pada penelitian iniberdasarkan pada polaritas komponenantioksidan yang akan diekstrak (Markham1975). Alkohol yang merupakan senyawaserba guna karena dapat merusak membransel dalam jumlah yang lebih besar(Ghisalberti 1993). Menurut Harbone (1987)eter, kloroform, dan petroleum digunakanuntuk melarutkan lipid dan triterpenoid.Etanol, aseton, dan etil asetat digunakansebagai pelarut senyawa yang lebih polarmisalnya senyawa fenolik atau polifenolik.

Tabel 1 Hasil ekstraksi kulit kayu mahoniPelarut Berat ekstrak % ekstrakaseton 237.00 g 8.84%metanol 184.43 g 6.65%n-hexana 3.02 g 0.11%dietil eter 11.69 g 0.42%etil asetat 30.71 g 2.17%air 29.83 g 6.44%

Daya Hambat Ekstrak Terhadap RadikalDPPH

Pada penelitian ini daya hambat terbesaruntuk 50 ppm ekstrak metanol , fraksi n-heksana, fraksi dietil eter, fraksi etil asetat,ekstrak air dan vitamin E adalah masing-masing sebesar 81.33%, 12.74%, 23.40%,65.54%, 68.04%,dan 30.42% (Gambar 7).Kontrol positif yang digunakan padapenelitian ini adalah vitamin E yangmerupakan antioksidan yang tergolongsenyawa fenolik yang larut lemak sertaterletak di membran eritosit dan plasmalipoprotein. Sebagai antioksidan dalamtubuh, vitamin E bertindak sebagaiscavenger (penangkap) radikal-radikal bebasyang masuk ke dalam tubuh atau terbentukdi dalam tubuh dari proses metabolismenormal. Vitamin E bertindak sebagai donorion hidrogen dan dapat mengubah radikalperoksil (hasil peroksidasi lipid) menjadiradikal tokoferol yang kurang reaktif danrelatif stabil sehingga tidak mampu merusakrantai asam lemak (Widjaja 1997).

Pada penelitian ini digunakan metodeBlois yang dimodifikasi dengan buffer MES,buffer ini berfungsi untuk menjagakeseimbangan pH pada proses reaksi sampeldengan radikal DPPH. Oleh karena itu faktorperusakan radikal karena pH tidakmempengaruhi penelitian ini. Hasilpenelitian ini berbeda dengan penelitianRohman & Riyanto (2005). Pada penelitianRohman dan Riyanto besar daya hambatterbesar vitamin E adalah 87.17% tetapipada penelitian Rohman dan Riyanto tidakmenggunakan buffer MES sehinggapengaruh ketidakseimbangan pH dapatmempengaruhi kerusakan radikal DPPH.

Selain itu Menurut Francis (1985) asamaskorbat, karatenoid, dan tokoferol relatiftidak tahan terhadap udara dan oksigensedangkan senyawa flavonoid dan taninrelatif tahan. Oleh karena itu vitamin Emudah terdegradasi oleh radikal bebas yangberasal dari lingkungan sebelum didegradasioleh radikal yang berasal dari DPPH.Sedangkan sampel lebih sulit untukterdegradasi oleh radikal bebas dilingkungan ataupun rusak oleh oksigen.Karena sampel mengandung flavonoid dantanin sehingga besar daya hambat pada

sampel terhadap radikal DPPH lebih besar dibanding vitamin E.

Gambar 7 Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni terhadap radikal DPPH. etil asetat, metanol, air, vitamin E, dietil eter,

n-heksana.

Hasil ekstraksi yang mempunyai dayahambat terbesar pada penelitian ini adalahekstraksi dari ekstrak metanol, Hal inidikarenakan metanol merupakan senyawaserba guna karena dapat merusak membransel dalam jumlah yang lebih besar(Ghisalberti 1993). Metanol jugamerupakan senyawa polar yang sangat baikdalam mengekstrak senyawa fenolik yangterkandung dalam suatu bahan. Sampelkedua yang memiliki daya hambat terbesaradalah ekstrak air, sama seperti metanol, airjuga merupakan senyawa polar, sehinggakomponen fenolik yang bersifat polar jugabanyak terekstrak oleh pelarut ini. Pelarutyang menghasilkan daya hambat terbesarketiga adalah etil asetat. Menurut Harbone(1987) etil asetat digunakan sebagai pelarutsenyawa yang lebih polar misalnya senyawafenolik atau polifenolik. Menurut Hernanidan Rahardjo (2005), salah satu fungsi darisenyawa polifenolik adalah menangkapradikal bebas atau sebagai antioksidan.Sedangkan dietil eter dan n-heksana adalahpelarut yang bersifat non-polar sehinggaekstraksi kedua pelarut ini terhadap senyawafenolik dan flavonoid yang bersifat polarlebih kecil dan menyebabkan daya tangkapterhadap radikal bebas kecil. Selain itu n-

heksana juga merupakan pelarut yangberfungsi mengikat lemak yang umumnyasering dirusak oleh radikal bebas sehinggadalam jumlah yang sedikit menambahjumlah senyawa yang teroksidasi.

Pada penelitian pengukuran nilaiinhibition concentration 50 (IC 50) tidakdilakukan karena pada penelitian ini nilaidaya hambat maksimum terdapat padakonsentrasi 50 ppm sedangkan untukkonsentrasi diatasnya daya hambat sampelmenjadi tidak stabil. Selain itu, penelitianini menitikberatkan pada pemilihan sampelyang memiliki nilai daya hambat tertinggidibanding sampel lain. Sampel dengan dayahambat tertinggi akan dianalisis ke tahapidentifikasi dan potensi antioksidanflavonoid yang dikandungnya.

Sistem Oksidasi Asam linoleatPenentuan waktu inkubasi asam linoleat

bertujuan mengetahui lama inkubasi yangperlu dilakukan dalam menentukan dayaantioksidasi sampel. Hasil penelitianmenunjukkan bahwa absorbansi terbesarterjadi pada hari ke-4. Berdasarkan hasilpenelitian ini, pengukuran MDA total sistemasam linoleat dan sampel dilakukan dua harisetelah kadar hidroperoksida maksimum

dengan asumsi semua hidroperoksida yangtelah terbentuk terdekomposisi menjadiMDA (Kikuzaki & Nobuji 1993).

Gambar 8 menunjukkan keadaanhidroperoksida selama inkubasi. Konsentrasihidroperoksida sebanding dengan nilaiabsorbansi sampel. Pada penelitian ini nilaiabsorbansi sampel tidak naik dan turunsecara konstan namun pada hari ke-4 yangmerupakan waktu inkubasi maksimum nilaiabsorbansi sampel meningkat dan menurunsecara tajam. Hasil dari penentuan waktuinkubasi maksimum pada penelitian iniberbeda dengan yang diperoleh Syaefudin(2008). Pada penelitian Syaefudinabsorbansi sampel cenderung naik dankemudian turun secara konstan.

Perbedaan peningkatan dan penurunannilai absorbansi pada penelitian ini dengannilai absorbansi sampel yang dilakukan olehSyaefudin (2008) dapat disebabkan olehpola pengambilan sampel. Pada penelitianini sampel diambil pada botol yang samasetiap harinya sehingga udara dapat masukke dalam botol dan mempengaruhi oksidasiasam linoleat yang ada dalam botol karenamenurut Halliwel dan Gutteridge (1985),diacu dalam Wiseman et al. (2005) lipidadalah senyawa yang sangat sensitifterhadap radikal bebas dari udara.

Gambar 8 Penetuan waktu inkubasimaksimum asam linoleat.hasil pengukuran.

Konsentrasi Malondialdehida danAktivitas Antioksidan Ekstrak

Ekstrak yang dianalisis potensiantioksidannya dengan menggunakanmetode TBA untuk mengukur MDA adalahekstraki metanol dan ekstrak air (karenakedua ekstrak inilah yang larut di dalam air).Sebagai pembanding pada penelitian inidigunakan juga vitamin E seperti padametode DPPH. Kisaran konsentrasi yangdigunakan pada penelitian ini adalah 50,100,dan 200 ppm. Karena antioksidan sepertivitamin E memiliki aktivitas antioksidan invitro maksimum pada 200 ppm (Coppen1983). Selain itu nilai konsentrasi inimerupakan batas maksimum kandunganantioksidan yang diperbolehkan padamakanan (Hernani & Rahardjo M 2005).

Analisis antioksidasi ini dilakukan padahari ke-6 inkubasi. Diharapkan semuahidroperoksida yang terbentuk sebagai hasiloksidasi asam telah mengalami dekomposisimenjadi MDA. Prinsip metode MDA adalahmengukur produk oksidasi asam linoleat,yaitu MDA yang bereaksi dengan asamtiobarbiturat menghasilkan produk berwarnamerah yang diukur pada panjang gelombangλ 532 nm (Kikuzaki & Nakatani 1993).

Untuk pembuatan kurva standardigunakan larutan standar TMP, TMPmerupakan prekusor MDA karena dari hasilhidrolisis TMP dengan air menghasilkanMDA. Oleh karena itu, larutan stok TMPdapat digunakan sebagai standar MDA.Persamaan garis linier yang diperoleh darikurva standar digunakan untuk menentukankonsentrasi MDA adalah y = 0.097x + 0.141dengan nilai R2 = 0.994 (Lampiran 7).Proses autooksidasi asam linoleat dapatdihambat oleh senyawa antioksidan,sehingga MDA yang terbentuk akan lebihsedikit daripada tanpa penambahan senyawaantioksidan. Nilai serapan yang diperolehsebanding dengan konsentrasi MDA danberbanding terbalik dengan aktivitasantioksidasinya. Nilai serapan yangketerbacaannya rendah menunjukkan adanyaaktivitas antioksidasi yang tinggi. Nilaiserapan dan daya hambat yang diperolehpada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel2 dan Gambar 9. Ekstrak metanol adalahekstrak yang memiliki daya antioksidasiterbesar.

Tabel 2 Konsentrasi MDA dan % daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni

Gambar 9 Daya hambat ekstrak kulit kayu mahoni terhadap pembentukan MDA. vit E, metanol, air.

Ekstrak metanol memiliki daya hambatterbesar dikarenakan metanol yang adalahsenyawa serba guna karena dapat merusakmembran sel dan mengekstrak endoselulerdalam jumlah yang lebih besar (Ghisalberti1993) dan metanol juga merupakan senyawapolar yang sangat baik mengekstraksenyawa fenolik yang terkandung dalamsuatu bahan. Tetapi pada penelitian iniaktivitas ekstrak metanol lebih kecil jikadibandingkan dengan yang dihasilkanmetode DPPH. Hal ini dikarenakan padapenelitian ini pelarut yang digunakan adalahair sehingga aktivitas kelarutan metanolmenjadi sedikit berkurang jika dibandingkandengan metode DPPH yang menggunakanmetanol sebagai pelarut. Pada penelitian ininilai daya hambat vitamin E lebih kecil jika

dibandingkan dengan literatur Alfarabi(2008) sebesar 54.51% tetapi jikadibandingkan dengan Ayuningtyas (2006)sebesar 22.06% nilai aktivitas antioksidasivitamin E pada penelitian ini lebih besar.Perbedaan nilai aktivitas antioksidasivitamin E pada berbagai penelitiandisebabkan oleh sifat vitamin E yang sukarlarut dengan air sehingga ketikamenggunakan metode MDA yangpelarutnya air kelarutan vitamin E padasetiap percobaan berbeda. Selain ituMenurut Francis (1985) asam askorbat,karatenoid, dan tokoferol relatif tidak tahanterhadap udara dan oksigen sedangkansenyawa flavonoid dan tanin relatif tahan.Oleh karena itu vitamin E lebih mudahrusak sehingga aktivitas penghambatan

Konsentrasi MDA Daya hambat (%)sampel

50 ppm 100 ppm 200 ppm 50 ppm 100 ppm 200 ppm

Vit E0.02369 0.02066 0.01922 27.15 36.48 40.91

Ekstrak Air0.01851 0.01658 0.01475 43.09 49.01 54.6

FraksiMetanol 0.01335 0.01333 0.01307 58.96 59.02 59.81

pembentukan MDA oleh vitamin E dapatmenjadi lebih kecil. Sedangkan sampel lebihsulit untuk rusak karena sampelmengandung flavonoid dan tanin sehinggabesar aktivitas daya hambat pada sampelterhadap pembentukan MDA lebih besardibanding vitamin E.

Analisis Flavonoid ( Kuersetin) denganHPLC

Kadar kuersetin yang terdapat dalamsampel adalah 16 mg/100g sampel. Kadarkuersetin pada penelitian ini tidak berbedajauh jika dibandingkan kadar kuersetin dariapel segar (salah satu buah dengan kadarkuersetin yang tinggi) sebesar 17 mg/100gsampel serta lebih besar jika dibandingkanjus apel sebesar 2.5mg/l dan teh hitam 10-13mg/l (Hertog et al 1992).

Pendeteksian kuersetin pada penelitianini dilakukan menggunakan HPLC, detektoryang digunakan adalah detektor UV-Vis(Lee 2000). Flavonoid yang merupakanbagian dari senyawa fenolik, memilikiserapan pada panjang gelombang 250 nm.Hasil dari analisis HPLC Gambar 10menunjukkan adanya peak (puncak) yanghampir sama antara hasil kromatogramsampel (ekstrak metanol karena sampeldari ekstrak metanol memiliki dayaantioksidan tertinggi pada 2 uji antioksidan)dan kromatogram standar (kuersetin)(Gambar 10).

Gambar 10 Hasil HPLC standar kuersetin(a), sampel ekstrak metanol(b).

Isolasi Flavonoid (Kuersetin) denganKLT dan Uji Aktivitas Antioksidan

Flavonoid (Kuersetin)Hasil proses pemisahan dengan KLT

tidak memperlihatkan warna di lempenganKLT (Gambar 11) sehingga harus dilakukanvisualisasi dengan menggunakan sinar UV.Hasil visualisasi menggunakan sinar UVmenunjukkan bahwa dari 3 kali pengulangansampel, sampel terpisah oleh pengembangdan memiliki faktor retensi (Rf) yang samadengan standar kuersetin yaitu 0.8625(Gambar 12). Pada proses KLT sampel yangdigunakan sama dengan sampel yangdigunakan pada proses HPLC yaitu ekstrakmetanol.

Pada penelitian ini KLT dilakukandengan menggunakan silika berfluoresensF254 dan pengembangan dilakukan denganmenggunakan pelarut metanol. Christie(1982) menyatakan bahwa silika gel adalahadsorben yang paling umum digunakanuntuk berbagai tujuan pada prosespemisahan dengan metode kromatografi.Metanol digunakan sebagai pengembangkarena metanol merupakan senyawa yangbersifat polar sehingga dapatmengembangkan senyawa kuersetin yangbersifat polar.

Gambar 11 Hasil dari KLT ekstrak metanolkulit kayu mahoni (a) Standarkuersetin.

Gambar 12 Hasil visualisasi menggunakanUV-VIS dari KLT ekstrakmetanol kulit kayu mahonistandar kuersetin (a), fraksimetanol I (b), fraksi metanolII (c), fraksi metanol III (d).

Selanjutnya setelah proses KLT,dilakukan isolasi kuersetin dari hasil KLTdengan proses pengerokan dan pelarutan kedalam metanol. Namun karena kuersetinyang ada pada lempengan silika sangatsedikit maka proses isolasi kuersetin darisampel tidak dilakukan. Oleh karena itu, ujiaktivitas antioksidan kuersetin padapercobaan ini dilakukan denganmenggunakan standar kuersetin.

Uji aktivitas antioksidan dilakukandengan menggunakan metode DPPH karenasampel yang digunaka adalah fraksi metanolyang larut dengan pelarut metanol yangdigunakan pada metode DPPH. Konsentrasiyang digunakan 50 ppm, 100 ppm, 200 ppmdan daya hambat yang dihasilkan sebesar87.2%, 89.1%, 92.8% (Gambar 13). Dayahambat kuersetin ini cukup tinggi dan terusnaik secara linear, namun tidak terlaluterpengaruh oleh konsentrasi karena % dayahambat yang didapatkan dari ketigakonsentrasi tersebut tidak berbeda nyata.

Gambar 13 Daya hambat kuersetin sebagaiantioksidan.

SIMPULAN DAN SARAN

SimpulanKulit kayu mahoni menunjukkan

aktivitas antioksidan pada metode DPPHdan metode MDA-TBA. Ekstrak yangmemiliki potensi antioksidan tertinggiadalah ekstrak metanol. Pengidentifikasianesktrak metanol dari kulit kayu mahonimenggunakan HPLC dan KLTmenunjukkan adanya flavonoid (kuersetin)dalam kulit kayu mahoni. Flavonoid(kuersetin) yang terkandung dalam kulitkayu mahoni sebesar 16mg/100g sampel.Flavonoid (kuersetin) memiliki potensiantioksidan yang sangat tinggi dan terusnaik secara linear.

SaranPerlu dilakukan penelitian lebih lanjut

mengenai identifikasi dan uji aktivitasantioksidan flavonoid jenis lain. Serta perlujuga dicari metode isolasi senyawa yanglebih baik misalnya menggunakankromatografi kolom, KLT preparative danHPLC preparatif.

DAFTAR PUSTAKA

Adawiyah DR, Sarastani D, Fardiaz D.2001. Kajian aktivitas antioksidan buahatung (Parinarium glaberimum Hassk.).[laporan penelitian]. Bogor: FakultasTeknologi Pertanian, Institut PertanianBogor.

Alfarabi M. 2008. Aktivitas antioksidanekstrak daun sirih merah ( Pipercrocatum) [skripsi]. Bogor: FakultasMatematika dan Ilmu PengetahuanAlam, Institut Pertanian Bogor.

Amic D, Dusanka DA, Beslo D, Trinasjtic.2003. Structure-radikal scavengingactivity relationship of flavonoids.Crotia Chem Acta 76:55-61.

Atmosukarto K, Mitri R. 2003. Mencegahpenyakit degeneratif dengan makanan.Cermin Dunia Kedokteran. 140:41-49.

Ault A. 1976. Techniques and Experimentsfor Organic Chemistry. Boston:Holbrook Pr.

Ayuningtyas I. 2007. Potensi antioksidasiekstrak daun keji beling (Strobilanthescrispus Blume.) [skripsi]. Bogor:

Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam, Institut PertanianBogor.

Brooke L. 1990. Other metabolites fromSwietenia macrophylla King. Agr Fiji29: 19-20.

Blois MS. 1958. Antioxidant determinationsby the use of a stable free radical.Nature 181:1199-1200.

Falah S, Suzuki T, Katayama T. 2008.Chemical constituent from Swieteniamacrophylla bark and their antioksidanactivity. Pak J Biol Sci 11:2007-2012.

Falakh S. 2008. Aktivitas antioksidanekstrak jamur kuping hitam(Auricularia polytricha) [skripsi].Bogor: Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam, Institut PertanianBogor.

Francis FJ. 1985. Pigments and othercolorants. Di dalam: Food Chemistry.Ennema OR, editor. New York: MarcelDekker.

Ghisalberti EL. 1993. Detection andisolation of bioactive natural products.Di dalam:. Bioactive Natural Products:Detection, Isolation andDeterminations. Colegate SM,Molyneux RJ, editor. Florida: CRC Pr.

Gritter RJ, Bobbitt JM, Schwarting AE.1991. Pengantar Kromatografi. Ed Ke-2. Padmawinata K, penerjemah;Bandung: ITB. Terjemahan dari:Elements of Chromatography

Harbone JB.1987.Phytochemical Methods.London : Chapman and Hall Ltd

Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia AnalitikDasar. Jakarta: Gramedia Pustaka

Hart H. 1983. Kimia Organik Suatu KuliahSingkat. Ed-11. Achmadi S,penerjemah; Jakarta: Erlangga.Terjemahan dari: Organic Chemistry.

Hefman E. 1976. Chromatography ofSteroids. New York: Elsevier ScientificPubl.

Hernani, Rahardjo M. 2005. TanamanBerkhasiat Antioksidan. Jakarta:Penebar Swadaya.

Hertog et al. 1992. Optimatization of aquantitative HPLC determination ofpotentially anticarcinogenic flavonoid invegetables and fruits. Agr Food 40:1591-1598.

Hertog et al. 1992. Content of potentiallyanticarcinogenic flavonoids of 28vegetables and 9 fruits commmnlyconsumed in The Netherlands. AgrFood 40: 2379-2383.

Kartikawati D. 1999. Studi efek protektifvitamin C dan vitamin E terhadaprespon imun dan enzim antioksidanpada mencit yang dipapar paraquat.[tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor.

Kikuzaki H, Nobuji N. 1993. Antioxidanteffect of some ginger constituents. FoodSci 58:1407-1410.

Langseth L. 1995. Oxidant, antioxidant, anddisease prevention. Di dalam: ILSIEurope Concise Monograph Series 1-24. Brussel: Belgium.

Lee HS. 2000. HPLC Analysis of phenoliccompounds. Di dalam: Food Analysisby HPLC. Nollet LML, editor. NewYork: Marcel Dekker Inc.

Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia.Thenawidjaja M, penerjemah; Jakarta:Erlangga. Terjemahan dari: Principlesof Biochemistry.

Markham KR. 1982. Techniques ofFlavonoids identification. London:Academic Pr.

Murray RK, Granner DK, Mayes PA,Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper.Ed-25. Hartono A, Bani AP,Sikumbang TMN, penerjemah;Jakarta: EGC. Terjemahan dari:Harper’s Biochemistry.

Miller AL.1996. Antioksidant flavonoids:structure, function, dan clinical usage.Alt Med Rev 1: 103-111.

Mimić-Oka J, Simic DV, Simic TP. 1999.Free radicals in cardiovascular disease.Sci J Fac Univ 6:11-12.

Pomeranz Y, CE Meloan. 1994. FoodAnalysis, Theory and Practise. NewYork: Chapman and Hall.

Rounds MA, JF Gregor. 2003. HighPerformance Liquid Chromatography.Di dalam: Food Analysis. Nielsen SS,editor . New York: Plenum Publ.

Schultz HW. 1962. Symposium on Food:Lipid and their Oxidation. Connecticut:The Avi Publ.

Spencer et al. 2003. Metabolism in the smallintestine and gasrtoinstestinal tract. DiDalam: Flavonoids in Health andDisease. Rice Evans CA dan PackersL, editor. New York: Marcel Dekker.

Sofianti D. 2006. Potensi antioksidan daunmahkota dewa ( Phaleria macrocarpaBoerl.) [skripsi]. Bogor: FakultasMatematika dan Ilmu PengetahuanAlam, Institut Pertanian Bogor.

Syaefudin. 2008. Aktivitas antioksidasiformula ekstrak jati belanda (Guazumaulmifolia Lamnk.), jambu biji ( PsidiumGuajava Linn.), dan salam ( Eugeniapolyantha Wight.) [skripsi]. Bogor:Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam, Institut PertanianBogor.

Taher A. 2003. Peran fitoesterogen kedelaisebagai antioksidan dalampenanggulangan aterosklerosis [tesis].Bogor: Sekolah Pascasarjana, InstitutPertanian Bogor.

Tensiska. 2001. Aktivitas antioksidanekstrak buah andaliman (Zanthoxylumacanthopodium DC) dalam beberapasistem pangan dan kestabilanaktivitasnya terhadap suhu dan pH.[tesis]. Bogor. Sekolah Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor

Tombilangi AK . 2004. Khasiat ekstrak daunjati belanda ( Guazuma ulmifoliaLamnk.) terhadap kadar lipid peroksidadarah kelinci yang hiperlipidemia[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, InstitutPertanian Bogor.

Turkoglu A et al. 2006. Antioxidant andantimicrobial activities of Morchellaconica. Afric J Biotechnol 5:1146-1150.

Tuminah S. 2000. Pencegahan kankerdengan antioksidan. Cermin DuniaKedokteran 122:21-23.

Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi.Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Wiseman et al. 2005. Biomolecular FreeRadical Toxicity: Cause andPrevention. New York: John Wiley &Sons.

Yagi K. 1994. Lipid peroxides in hepatic,gastrointestinal, and pancreatic diseases,Di dalam: Free Radicals in DiagnosticMedicine. Amstrong D, editor. NewYork: Plenum Pr.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Alur Penelitian

Ekstraksi/ fraksinasi

Uji antioksidan

Metode MDA-TBA Metode DPPH

Analisis Flavonoid(HPLC)

(

Uji antioksidanflavonoid

Isolasi flavonoiddengan KLT

Lampiran 2 Ekstraksi dan fraksinasi kulit kayu mahoni

Serbuk kayumahoni

Ekstraksi 3 kalidengan aseton

Ekstraksidengan air

Ekstrak aseton

Ekstrak metanol

Ekstrak kembalidengan aseton dan

suspensikan dengan air

Dipisahkan dengan n-heksana

Dipisahkan dengandietl eter

Fraksi heksana

Dipisahkan dengan etilasetat

etil

Fraksi dietil eter

Fraksi etil asetat

Residu serbuk

Ekstraksi denganmetanol

Lampiran 3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH

Sampel ditambah dalam campuran 0.4mMDPPH, 20% larutanMeOH, MES buffer(1mL:1mL:1mL)

divortex selama 20menit

Absorbansinya diukurpada λ 517 nm

Lampiran 4 Metode pengujian potensi antioksidasi metode MDA-TBA

Inkubasi pada 40°C dengan lama

berdasar hasil analisis hidroperoksida

tiap larutan ditambah 2 mL TCA 20%

dan 2 mL TBA 1% (b/v) dalam asam

asetat 50% (v/v)

Sentrifus pada kecepatan 3000 rpm

selama 15 menit

Campuran sampelCampuranpembanding

Campuran kontroltanpa perlakuan

Diambil 1 mL masing-masing larutan

Inkubasi pada suhu 100°C, selama 10menit

Didinginkan pada suhukamar

Supernatant diukur pada λ 532 nm

Lampiran 5 Analisis kadar air kulit kayu mahoni

UlanganKeteranganI II II

Bobot pinggan 28.49 g 34.30 g 36.23gBobot sampel awal 2 g 2 g 2 gBobot pinggan + sampel telah di oven 30.34 g 36.15 g 38.08 gBobot sampel akhir 1.85 g 1.85 g 1.85 g% kadar air 7.5% 7.5% 7.5%Rata-rata % kadar air 7.5%

Perhitungan % kadar air: (a-b) x 100%

a

: (2-1.85) x 100%

2

= 7.5%

Rata-rata % kadar air = kadar air I + kadar air II + kadar air III

3

= 7.5% +7.5% + 7.5%

3

= 7.5%

Ket a : bobot sampel

b : bobot sampel setelah pemanasan

Lampiran 6 Hasil fraksinasi ekstrak aseton kulit kayu mahoni dengan berbagaipelarut

Hasil maserasi ekstrak aseton kulit kayu mahoni dengan pelarut aseton, methanol,n-hexana, dietil eter, dan etil asetat (Lampiran 2)

Sampel ekstrak asetonPelarut Berat ekstrak % ekstrakaseton 237 g 8.84%n-hexana 3.02 g 0.11%dietil eter 11.69 g 0.42%etil asetat 30.71 g 2.17%

Pembanding ekstrak air dan ekstrak methanolPelarut Berat ekstrak % ekstrakair 29.83 g 6.64%metanol 184.43 g 6.65%

% ekstrak = berat ekstrak x 100% (kulit kayu mahoni- kadar air )

Lampiran 7 Kurva standar TMP

Data

SerapanKonsentrasi TMP(µM) 1 2 3 Rerata

3 0.251 0.257 0.251 0.253

6 0.322 0.323 0.322 0.322

9 0.427 0.432 0.427 0.429

12 0.533 0.520 0.533 0.529

15 0.638 0.638 0.638 0.638Keterangan : Persamaan garis linier yang dihasilkan digunakan untuk menentukan

konsentrasi MDA

Grafik

Lampiran 8 Hasil pengujian aktivitas antioksidasi dengan metode TBA

Ekstrak Ulangan Absorban [MDA]Rataan[MDA] Std dev

% dayahambat

kontrol (-) 1 1.541 0.0430 0.03252 0.43063 0.00%

2 0.932 0.0243

3 1.125 0.0302

Vit E (50 ) 1 1.071 0.0286 0.02369 0.16052 27.15%

2 0.750 0.0187

3 0.915 0.0238

Vit E (100) 1 1.041 0.0277 0.02066 0.17241 36.48%

2 0.724 0.0164

3 0.765 0.0179

Vit E (200) 1 0.878 0.0226 0.01922 0.00297 40.91%

2 0.710 0.0175

3 0.711 0.0175

metanol (50) 1 0.763 0.0180 0.01335 0.00432 58.96%

2 0.500 0.0095

3 0.592 0.0125metanol(100) 1 0.728 0.0180 0.01333 0.00429 59.02%

2 0.451 0.0095

3 0.547 0.0125metanol(200) 1 0.726 0.0180 0.01307 0.00459 59.81%

2 0.430 0.0089

3 0.543 0.0124

air (50) 1 0.809 0.0205 0.01851 0.00206 43.09%

2 0.675 0.0164

3 0.746 0.0186

air (100) 1 0.710 0.0175 0.01658 0.00135 49.01%

2 0.630 0.0150

3 0.702 0.0172

air (200) 1 0.705 0.0173 0.01475 0.00271 54.65%

2 0.529 0.0119

3 0.629 0.0150

Ket: [ MDA] = konsentrasi MDA

Std dev = standar deviasi.

Lampiran 9 Hasil analisis statististik konsentrasi MDA dengan metodeTBA

The SAS SystemAnalysis of Variance Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

PELARUT 3 a b c

KONSENTRASI 3 1 2 3

Number of observations in data set = 27

The SAS SystemAnalysis of Variance Procedure

Duncan's Multiple Range Test forNOTE: This test controls the type Icomparisonwise error rate, not the

experimentwise error rateAlpha= 0.05 df= 18 MSE= 0.000017

Number of Means 2 3Critical Range .004025 .004223

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N PELARUT

A 0.021989 9 a

B 0.017856 9 cBB 0.014089 9 b

The SAS SystemAnalysis of Variance Procedure

Duncan's Multiple Range Test forNOTE: This test controls the type Icomparisonwise error rate, not the

experimentwise error rateAlpha= 0.05 df= 18 MSE= 0.000017

Number of Means 2 3Critical Range .004025 .004223

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N KONSENTRASI

A 0.018956 9 1AA 0.017822 9 2AA 0.017156 9 3

Lampiran 10 Hasil HPLC kulit kayu mahoni fraksi metanol

Standar kuersetin

Sampel

Lampiran 11 Hasil pengujian aktivitas antioksidan kuersetin metode DPPH

Kuersetin Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rata-rataDaya

hambat

blanko 0.683 0.690 0.685 0.686 -----

50 ppm 0.090 0.089 0.084 0.088 87.20%

100 ppm 0.073 0.077 0.075 0.075 89.10%

200 ppm 0.048 0.052 0.049 0.050 92.80%