http://www.microbiologia.unige.it/dpb/ indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Appunti di Microbiologia Informazioni: Prof Eugenio Debbia Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche DISC-Sezione di Microbiologia, Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova Tel: 010-353 38136, 329 260 5218 FAX: +39-010-353 7651 http://www.microbiologia.unige.it/dpb/ indexxx.htm e-mail: [email protected]
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Epidemiologia
Appunti di Microbiologia
Informazioni:Prof Eugenio DebbiaUniversità di Genova Scuola di Scienze Mediche e FarmaceuticheDISC-Sezione di Microbiologia, Largo Rosanna Benzi 10,16132 GenovaTel: 010-353 38136,329 260 5218 FAX: +39-010-353 7651
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Testi consigliati.
Antonelli et al. Principi di Microbiologia Medica II ed. CEA 2012
La Placa Microbiologia Medica. Edises 2014
Jawetz et al. Microbiologia Medica. Piccin 2012
MICROBIOLOGIA
• Batteri
• Virus
• Miceti
• Protozoi e altri parassiti
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MicrorganismiOrganismi unicellulari
EucariotiNucleo evidente con
membrana
Batteri Nucleo non evidente
AlgheProtozoiMiceti
EubatteriClamidie
SpirocheteRickettsie
Micoplasmi
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Cellula Eucariotica
Nucleo
Cellulaprocariotica
BATTERIdimensioni
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Citoplasma Nucleoide Ribosomi
Paretecellulare Membrana
citoplasmatica
Membranacitoplasmatica
Reticolo endoplasmatico
RibosomiNucleo
NucleoloMembrananucleare
Citoplasma
Mitocondrio
Cloroplasto
STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICAa) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA
plasmide
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Proteine
Acidi nucleici
Lipidi
Polisaccaridi
Nucleoide Ribosomi
GranuliD’accumulo
Parete
CitoplasmaFlagelloMembrana
Composizione: H2O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S e macromolecole organiche
localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica
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G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini Principi di Microbiologia medica, II ed. Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
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1. Cocchi, 2. Diplococchi,
3. Streptococchi, 4. Stafilococchi
5.Tetradi di cocchi, 6. Coccobacilli
7. Clostridi, 8. Bastoncini,
9. Carbonchi, 10. Fusobatteri
11. Vibrioni, 12. Spirilli
13. Borrelie, 14. Treponemi
15. Leptospira
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COLORAZIONE semplice DELLE CELLULE PER L’OSSERVAZIONE
MICROSCOPICA
Strisciare la coltura su un vetrinoFormando uno strato sottile
Asciugare all’aria
Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione
Ricoprire il vetrino con coloranteRisciacquare e asciugare
Porre una goccia d’olio (da immersione) sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x
Vetrino Olio
100x
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COLORAZIONE DI GRAM (complessa o differenziale)
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 2-3 minuti
Tutte le cellule si coloreranno di viola
Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto
Le cellule rimarranno viola
Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti
Le cellule Gram-positive risulteranno viola, quelle Gram-negative incolori
Colorare con fucsina per 1-2 minutiG-
G+
Le cellule Gram-positive (G+) risulteranno viola, quelle Gram-negative (G-) avranno una tonalità da rosa a rosso
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La colorazione di Gram
Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo
Bastoncelli Gram negativi misti a cocchi Gram positivi
Cocchi Gram positivi
Cocchi Gram positivi
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Colorazione di Ziehl-Neelsen(bacilli alcool-acido resistenti)
Fucsina fenicata a caldo 5 mAcido solforico (20%) 30’’Alcool 30’’Blu di metilene 1 m
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Batteri alcool-acido resistenti: rossi su fondo blu azzurro
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Osservazione a contrasto di fase
Un batterio (L. sakei), 400x
Un lievito (S. cerevisiae),400x
Una muffa (G. candidum),400x
Un attinomicete400x
Un lievito (Y. lipolytica)400x
Una muffa (R. oligosporus),400x
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Osservazione in campo scuro
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Anatomia della cellula batterica
Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano:
a) glicocalice o slimeb) capsulac) flagelli, pili o fimbried) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram-positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram)e) membrana citoplasmaticaf) mesosomig) citoplasma cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. ribosomicorpi inclusi
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Glicocalice
Materiale stratificato intorno alla cellula
Strato S: distribuzione regolare (cristallina) di sub-unità glicoproteiche
Capsula: matrice fibrosa costituita da polimeri di carboidrati
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Flagelli
Moto browniano
Movimento attivo
Flagello: unico filamento sprovvisto
di membrana – flagellina-
(diversa in specie batteriche diverse)
chemiotassi
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STRUTTURA DI UN FLAGELLO
BATTERICO
Membranacitoplasmatica
Proteina Mot
Periplasma
Proteina Fli invertitore del motore
Anello MS
Peptidoglicano
Anello P
Anello L
Uncino
Flagellina
Filamento
Membrana Esterna LPS
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Pili o Fimbrie
Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli, sono costituite da una proteina detta pilina che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione dei batteri ad altre cellule (patogenicità). Spesso sono codificati dai plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per l'adesività sia come pilo detto sessuale per creare un ponte citoplasmatico tra due cellule batteriche nei processi di coniugazione.
Morfologia delle adesine
Type IV fimbriae (= bundle forming pilus)
Type I fimbriaeAfimbrial adhesin
Curli
ADESINE BATTERICHE
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La Parete (Cell-Wall)
E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula
Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici
Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS)
Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva
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Gram positivi Gram negativiPeptidoglicano
Membrana citoplasmatica
Peptidoglicano
MembranaPeriplasma
Membrana esternaLipopolisaccaridi eproteine
RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA
DELLA PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI
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PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI
Acido teicoicoProteina associata alla parete
Acido lipoteicoico
Peptidoglicano
Membrana citoplasmatica
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BATTERIO GRAM NEGATIVO
Membrana esterna
Membrana citoplasmatica
Peptidoglicano
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PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI
Membrana esterna
Periplasma
Membranacitoplasmastica Interno
FosfolipidePeptidoglicano
Lipoproteina
Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico
Lipide APorina
Esterno
Lipopolisaccaride (LPS)
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Enzimi attivi sulla parete
Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale,
Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi, amidasi e peptidasi
(enzimi che intervengono sulla sintesi di parete).
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Membrana citoplasmatica
Costituita da fosfolipidi e proteine, non contiene steroli (negli eucarioti) presenta invaginazioni: i mesosomi importanti nella formazione del setto vi è attaccato il DNA in certe specie su altri mesosomi vi è un sistema di trasporto attivo (fotosintesi, azoto)
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Doppio strato fosfolipidico della Membrana Citoplasmatica batterica
Regione idrofila
Regione idrofobica
Acidi grassi
H2O
FosfatoGlicerolo
Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++)
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STRUTTURA DELLA MEMBRANA
CITOPLASMATICA
MolecolafosfolipidicaProteine integrali
di membrana
Fosfolipidi Esterno Gruppi idrofilici
Gruppi idrofobici
Interno
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Membrana citoplasmatica Funzioni
permeabilità selettiva e trasporto,trasporto elettroni e fosforilasi ossidativaescrezione enzimi idroliticicontiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi
Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica
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FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA
Barriera di permeabilità
Sito di ancoraggio
Produzione dell’energia
Previene dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula
Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle vie biosintetiche e nella chemiotassi
Enzimi della catena respiratoria
Mesosomi ?
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Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellulagenera ATP.
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Lo spazio periplasmico
E’ compreso tra la membrana interna e quella esterna, è riempito da un gel formato da peptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sono inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi alcalina che reagendo con substrati li rendono trasportabili all’interno. Molti di questi composti intervengono nella regolazione della pressione osmotica, per esempio, cellule che crescono in ambiente ipotonico aumentano la sintesi di oligosaccaridi.
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LEGAME TRA LE UNITA’ PEPTIDICHE E GLICANICHE NELLA FORMAZIONE DELLO
STRATO DI PEPTIDOGLICANO
Staphylococcus aureus(Gram positivo)
Scheletro del glicano
Peptidi
Escherichia coli(Gram negativo)
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
sono NOTI SEI SISTEMI di esportazione di molecole effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite (49, 100, 293). L.energia necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella faccia interna della membrana citoplasmica. Alla secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari sistemi (5).
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porinaComplesso trimerico ABC (ADP binding cassette) .one-step., cioè senza modifiche o clivaggi a
livello del periplasma, composto dal trasportatore ABC. La sequenza segnale è presente nel termine C della
(Tol C). È responsabile della secrezione dell.emolisina HlyA dell.E. coli, dell.adenilato ciclasi (B. pertussis),
leucotossina (P. haemolytica) proteasi (P. aeruginosa), e di altre tossine (107).
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esternoSistema (.two-step.) in cui avviene prima clivaggio della sequenza leader poi il passaggio,
attraverso la membrana interna tramite sistema sec e/o GSP (General Secretory pathway), nel periplasma,
quindi trasporto della proteina matura (troncata al termine .N) nella membrana esterna mediato da 12
proteine presenti nella membrana interna (alcune simili a proteine dei pili tipo IV ed all.apparato .export. di
batteriofagi filamentosi ed alla proteina secretina del sistema III). Il canale di passaggio è proporzionato alle
dimensioni delle molecole (proteasi, lipasi, fosfo lipasi, cellulasi, pectinasi) o tossine da esportare, come la
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tossina colerica (CTx), pullulanasi di K. oxytoca, aerolisina di A. hydrophila, e tossine di diverse specie
patogene appartenenti alla famiglie delle Legionelle, Enterobatteriacee, Pseudomonadacee (5).
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringaTIPO III: Sistema (.one step.) composto da un complesso di oltre 20 proteine che si assemblano in un
canale altamente regolato che attraversa la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna, a guisa di
siringa munita di relativo ago da iniezione che penetra nella membrana della cellula bersaglio. Visibile al
microscopio elettronico come struttura similflagellare con corpo conformato a dischi sovrapposti e l.ago di
varia lunghezza a seconda della specie batterica (ad es., 50-588 nm. nei coli EPEC, molto più corto nelle
shigelle) (296bis). Questo sistema è usato da numerosi batteri, come: Salmonelle, Shigelle, Yersinie, E. coli
EPEC e EHEC, Legionelle, Vibrioni, Aeromonas, Chlamydia spp, B. bronchiseptica, Pseudomonas
aeruginosa, Erwinia (18, 37, 100, 148, 293, 294, 296bis, 353, 354). Il sistema delle Salmonelle è codificato
da tre isole cromosomiche di patogenicità (Quadro3). Nelle Shigelle i geni codificanti il sistema III sono
situati invece in un plasmide di 220 Kb.
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente) Sistema (.two-step.) composto da circa 30 proteine (descritto prima per le IgA-1 proteasi e poi
per varie adesine, invasine e tossine, fattori di motilità, siero-resistenza). È un Sistema di autotrasporto:
Come funziona?
1) Viene sintetizzata una poliproteina (precursore) che poi è esportata con apparato .sec.
2) Clivaggio della sequenza leader della poliproteina da peptidasi sulla membrana citoplasmica
3) Liberazione nel periplasma della proteina matura 4) Il dominio β (poro) si inserisce nella membrana esterna ! struttura .β Barrel. o foro
(conformazione proteica complessa composta da foglietti β multipli antiparalleli con due superfici amfipatiche, una idrofila e una idrofobica)
5) Traslocazione del dominio attraverso il canale verso l.esterno con clivaggio proteolitico e liberazione della proteina matura (ad es.: IgA-1 proteasi)
Perché è definito .autotrasportatore.?
Perché il passaggio della proteina nell.OMP (outer membrane protein) è mediato dal suo Ctermine senza bisogno di energia e di fattori accessori per il processo di traslocazione. Impiegato per la secrezione di proteine (tossine) o complessi proteine-DNA con comuni sequenze aminoacidiche nei domìni N- e C-terminali e H (o passeggero) da numerosi batteri: - Rickettsia spp. (rOmpA, B, SipT) - B. pertussis (BrkA), B. parapertussis (pertactina P70), B. bronchiseptica (TcfA), N.gonorrhoeae e meningitidis (IgA-1 proteasi) - E. coli (AIDA-1, Ag13, Esp C, Esp P, Pet, Tsh), S. flexneri (sepA, ShMu, IcsA), Serratia marcescens (Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2), H. influenzae (IgA-1 proteasi, Hap, Hia, Hsf), Moraxella catarrhalis (UspA-1, UspA-2) - Helicobacter pylori (VacA, CagA), H. mustelae (Hsr)
- L. pneum
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto)TIPO V: simile al tipo II in quanto usa il sistema di esportazione di tossine sec-dipendente per raggiungere ilperiplasma ma non abbisogna di proteine accessorie come il II e si comporta quindi da sistema autotrasportatorecome il sistema IV. Usato da: B. pertussis (FHA-B), H. influenzae (proteine ad alto PM oHMVs), H. ducreyi (adesina LspA), - P. mirabilis (emolisina Hpm).
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Sistemi di secrezione(Gram-negativi)
Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porinaTipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esternoTipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringaTipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente)Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto)
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Sistemi di secrezione(Gram-positivi)
Le proteine elaborate nel citoplasma sono trasferite a livello di membrana citoplasmatica qui alcune proteine vettore (chaperone) mediano il passaggio attraverso la parete durante il quale la proteina si trasforma nella versione funzionale con meccanismo non noto
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FUNZIONI DEL CROMOSOMA
Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basi appaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti, ciascuno dei quali determina una sequenza di aminoacidi e quindi la struttura di una proteina. Queste proteine, enzimi, componenti della membrana ecc. costituiscono le proprietà del microrganismo. Un segmento di DNA che determina un prodotto funzionale è chiamato gene. Gli eventi attraverso i quali una sequenza di nucleotidi di un gene determina una proteina sono i seguenti:
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L’enzima RNApolimerasi, usando il DNA come modello, forma una singola catena poliribonucleotidica chiamata RNA messaggero (mRNA). Questo processo è noto come trascrizione. Questo mRNA ha una sequenza nucleotidica che è complementare con una delle catene della doppia elica di DNA.
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Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente e trasferiti ad una molecola particolare di RNA chiamato RNA transfer (tRNA). Questi tRNA hanno una struttura che presenta ad una estremità una tripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremità hanno legato l’aminoacido corrispondente. La tripletta posta sul mRNA si chiama codon.
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mRNA ed il tRNA vanno insieme sulla superficie del ribosoma. Il tRNA trova la tripletta complementare sul mRNA. Il ribosoma si muove sul mRNA e la sintesi procede. Il processo è noto come traduzione.
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PLASMIDI
I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare che si replicano autonomamente (replicon, fattori R, elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti,
episomi, profagi non integrati). Codificano per funzioni non indispensabili per la cellula, ma che
possono essere fondamentali in particolari ambienti.
Diffusione della resistenza agli antibiotici
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PLASMIDI
Elementi genetici extracromosomici DNA circolare, doppia elica replicazione autonoma ( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene
4500 Kb = cromosoma
1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb
1ųm = 2 Mdal
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PLASMIDIClassificazione
Fenotipo Numero di copie Peso molecolare Frammenti di restrizione Gruppo di compatibilità Genetico e biochimico Fattori R coniugativi e non Amplificazione dei geni Batteriocine
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ENDOSPORE
Diversi microorganismi (gram+), quando le condizioni ambientali diventano sfavorevoli, sono in grado di formare endospore (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sono liberate nell’ambiente. La spora è una cellula in fase di riposo, altamente resistente al calore, all’essiccamento, e agenti chimici, quando le condizioni risultano nuovamente favorevoli la spora germina e produce una cellula vegetativa.
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Epidemiologia
Sporulazione
La sporulazione comporta la produzione di nuove strutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturali sono attivati durante il processo. Inizia con una invaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. La prespora si trova così racchiusa tra due membrane capaci di sintetizzare parete nella parte compresa tra loro. La prima struttura che appare si chiama corteccia, con internamente la parete della spora, all’esterno delle due membrane si costituisce la tunica sporale (mantello), ed oltre la tunica l’esosporio. Tutto richiede una gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico. All’interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimi vegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituenti della spora.
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htmDinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed
Epidemiologia
STADI DI FORMAZIONE DELL’ENDOSPORA
Stadio 0
Stadio 1
Stadio 2
Stadio 3 Stadio 4
Stadio 5
Stadio 6
Stadio 7
Cellula vegetativa
Parete
Membrana citoplasmatica
DNA
Spora in via di sviluppo
Membrana interna della spora
Membrana esterna della spora
CoreNucleo centrale
Disidratazione
Esosporio
Corteccia iniziale
Strati corticali
Esosporio
CoreSpora libera
7-10h
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Proprietà
Core: contiene il nucleo, tutti i componenti della sintesi proteica ed un sistema per generare energia basato sulla glicolisi. L’energia per la germinazione è conservata in 3-fosfoglicerato piuttosto che ATP. La resistenza è dovuta in parte allo stato disidratato e alla presenza nel core di dipicolinato di calcio (intermedio nella sintesi della lisina)
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Proprietà
Parete della spora E’ lo strato più interno di parete che circonda la MI della spora, composta di peptidoglicano (diventerà parete nella cellula quando germinerà)
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Proprietà
Cortex E’ lo strato più spesso dell’involucro della spora, contiene peptidoglicano ma con meno legami crociati di quello usuale. Sensibile al lisozima, la sua autolisi è importante durante la germinazione.
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Proprietà
Mantello E’ composto da proteine di tipo cheratinoso aventi molti legami disolfuro. Impermeabile agli agenti chimici.
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Proprietà
Esosporio Lipoproteina contenente alcuni carboidrati.
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Fisiologia della spora
Nessun consumo di O2
Attività enzimatiche assentiAssenza di sintesi macromolecolariResistenti agli UV e all’essiccazioneTermoresistenza: stabilità proteine (particolare stabilizzazione della struttura 2aria e 3aria), Ca, acido dipicolinico problema sterilizzazionePossono sopravvivere per decine di anni
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GERMINAZIONE Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita. Attivazione Anche se posta in ambienti favorevoli la spora non germina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione, acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi. Iniziazione Una volta attivata la spora, la germinazione avviene se certi effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questo mette in azione l’autolisina che degrada il cortex. E’ assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sono degradati gli altri costituenti della spora. Crescita Si osserva un rigonfiamento all’interno (core) e quindi sintesi di nuova parete su quella già presente (parete della spora) con successiva divisione cellulare.