curso practico microbiologia

CURSO DE MICROBIOLOGA GENERAL

Ctedra de Microbiologa Facultad de Qumica

2009 v3

CURSO DE MICROBIOLOGA 2009. GUA DE PRCTICO PRIMER CICLO Durante el primer ciclo (4 clases) se realizar la identificacin primaria de bacterias y hongos a partir de cultivos puros y de muestras de ambiente. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de: 1) Manejarse de acuerdo a las normas de bioseguridad. 2) Manejar y mantener el microscopio correctamente. 3) Trabajar aspticamente. 4) Preparar frotis y teirlos por Gram. 5) Reconocer morfologas microscpicas y coloracin Gram de bacterias. 6) Reconocer morfologas microscpicas caractersticas de hongos uni y pluricelulares. 7) Identificar bacterias (gnero/familia). 8) Preparar medios de cultivo. 9) Manejar el autoclave. 10) Preparar material para esterilizacin por calor seco. 11) Uso de Tablas de identificacin de bacterias. Al final del ciclo cada subgrupo (4 estudiantes) deber entregar un informe indicando: Grupo (n y horario), nombre de los estudiantes Resultados obtenidos: a) Muestra de ambiente: origen de la muestra, medio y condiciones de cultivo, descripcin macro y microscpica de las colonias obtenidas. b) Cultivos bacterianos problema: cdigo de la muestra, descripcin macro y microscpica de las colonias en el medio selectivo aportado, pruebas bioqumicas realizadas y datos obtenidos de cada una, gnero y/o Familia a la que pertenece el m.o. identificado.

Curso prctico Microbiologa General 2009

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Clase 1

Trabajo experimental- Observacin macro y microscpica de cultivos puros de bacterias (medios slidos y lquidos). - Tcnica asptica. Frotis y tincin de Gram. - Siembra de una muestra: superficie, piel, tierra, aire en TSA a) Muestra sembrada en 1 clase: - Observacin macroscpica de colonias. - Observacin microscpica: frotis, tincin de Gram. b) Identificacin de bacterias. Cada subgrupo recibir un m.o. (microorganismo) sembrado en un medio selectivo: - Observacin macroscpica de colonias. - Observacin microscpica: frotis, tincin de Gram. - Reaislamiento en medio no selectivo (ALRF y TSA). - Eleccin de pruebas bioqumicas. Con los datos obtenidos de las observaciones macro y microscpicas y usando la tabla, cada subgrupo deber elegir las pruebas necesarias para la identificacin primaria del m.o. a) Continuacin de la muestra sembrada en 1 clase. - Observacin macro y microscpica. b) Identificacin de bacterias: - Verificacin del reaislamiento por observacin macro y microscpica. - Siembra de pruebas de identificacin primaria. c) Observacin macro y microscpica de hongos en cultivos puros. d) Preparacin de medios (mitad del grupo). a) Muestra de ambiente: observacin macro y microscpica. b) Cultivo bacteriano puro: lectura de pruebas bioqumicas. c) Observacin de hongos, continuacin. d) Preparacin de medios de cultivo, continuacin. e) Entrega de informe y discusin de los resultados.

Material a estudiarNormas de bioseguridad. Utilizacin de microscopio. Citologa y morfologa de bacterias Siembra y aislamiento.

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- Siembra y aislamiento: aislamiento por estras, cultivo puro. - Medios generalidades; Tabla "Caractersticas de algunos medios"; Composicin de medios (manuales comerciales): ALRF, Mac Conkey, MSA, TSA, TSB. - Identificacin de bacterias: pruebas bioqumicas primarias: oxidasa catalasa, OF, relacin con el oxgeno (crecimiento en anaerobiosis), fermentacin de glucosa.

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- Identificacin de bacterias. - Siembra y aislamiento: preparacin de medios de cultivo y esterilizacin de material de vidrio. - Citologa y morfologa de hongos.

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SEGUNDO CICLO Durante el segundo ciclo (7 clases) se har el anlisis microbiolgico de una muestra para determinar si cumple con los requisitos exigidos segn una norma determinada. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante deber ser capaz de: 1) Realizar el anlisis microbiolgico de una muestra de acuerdo a una tcnica dada. 2) Informar adecuadamente los resultados del anlisis microbiolgico de una muestra. 3) Calcular las diluciones adecuadas a sembrar para realizar un recuento (en placa, NMP). 4) Manejar tablas de identificacin de bacterias. 5) Comprender las bases bioqumicas de las pruebas utilizadas en la identificacin. 6) Comprender la funcin de cada uno de los componentes de un medio de cultivo. 7) Realizar un esquema simplificado de una tcnica microbiolgica. En la clase 6 del ciclo cada subgrupo deber entregar el informe final (solo los resultados obtenidos) de la muestra analizada. En la clase 7 se deber entregar 2 fotocopias del informe del trabajo asignado en clase 5.


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Clase 1

Trabajo experimental

Observaciones y material a estudiar

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Anlisis microbiolgico de una muestra segn tcnica Tcnica microbiolgica para el anlisis de una aportada. Bsqueda de los 4 m.o. correspondientes y muestra recuentos de mesfilos, enterobacterias y hongos Muestreo para anlisis microbiolgico. Recuentos: Introduccin gral. y recuento en placa Continuacin con el anlisis microbiolgico. Aislamiento Discusin de medios de cultivo empleados: selectivo. Subcultivo a caldos selectivos. composicin y uso (manuales comerciales). Resultado preliminar del recuento de mesfilos y Test de esterilidad. enterobacterias. Recuento definitivo de mesfilos. Observacin de Informes de los resultados de recuento de colonias tpicas en medios selectivos. Aislamiento de mesfilos y enterobacterias los caldos selectivos de Salmonella. Clculo de diluciones a sembrar para recuentos Reaislamiento en medio no selectivo segn diferentes lmites. Gram de colonias tpicas. Pruebas primarias (catalasa, Recuentos: recuento por NMP. oxidasa). Uso de Tabla NMP. E. coli: IMViC. Lmites microbiolgicos para agua potable y Salmonella spp: Reaislamiento de colonias sospechosas agua de playa. en medio no selectivo. Identificacin de bacterias: pruebas Pseudomonas aeruginosa: crecimiento a 42 C, bioqumicas. pigmentos. Presentacin y discusin de pruebas S.aureus: catalasa, coagulasa o DNAsa bioqumicas. Recuentos: Siembra de agua potable o de playa por NMP. Recuento de hetertrofos en agua potable por filtracin. Leer recuento preliminar por NMP. Confirmacin de Discutir Farmacopeas. Ordenanza, normas UNIT, etc. coliformes totales y fecales. Siembra pruebas de tamizaje para Salmonella : TSI, Se entregarn diferentes trabajos de anlisis LIA Fenilalanina microbiolgico para presentar diseo de metodologa por escrito en forma de esuema (diluciones, medios, etc). Leer NMP. Leer bioqumicas de Salmonella. Leer Discutir resultados de NMP. resultado de recuento de hetertrofos por filtracin Discusin gral sobre el tema de identificacin y recuento de hongos. de una cepa bacteriana. Entregar resultados. Presentacin del trabajo de anlisis asignado en clase 5 por cada subgrupo.


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TCNICA GENERAL DE ANLSIS MICROBIOLOGICO DE UNA MUESTRA Especificaciones microbiolgicas para la muestra Recuento de mesfilos aerobios viables: menos de 1000 UFC/g Recuento de hongos y levaduras: menos de 100 UFC/g Recuento de Enterobacterias: menos de 100 UFC/g Ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella sp en 10 g. Preparar la muestra que se va a analizar mediante un tratamiento apropiado a sus caractersticas fsicas y que no altere el nmero y tipo de microorganismos originalmente presentes, a fin de obtener una solucin o suspensin adecuada para los procedimientos analticos que se van a efectuar. Es recomendable partir de una muestra no menor de 10 g (o mL) representativa del lote a analizar y preparar las diluciones en un solvente adecuado (suero fisiolgico, tampn fosfato o agua peptonada al 0,1%).

1 RECUENTOS 1 Preparacin previa de la muestra 1.1 Pesar aspticamente 10 g de la muestra y disolver o suspender en 90 mL de suero fisiolgico. Esta es la dilucin 1/10 o 10-1. 1.2 Pipetear 1mL de esta dilucin en cada una de tres placas de Petri estriles. Continuar el procedimiento en 2, 3 y 4. 2 Recuentos de mesfilos aerobios viables 2.1 Agregar inmediatamente a una placa 15 a 20 mL TSA (agar tripticasa soja), previamente fundido y termostatizado a 45 C. 2.2 Mezclar por rotacin y dejar solidificar a temperatura ambiente. 2.3 Incubar a 35 2 C durante 48 a 72 h. Examinar para verificar la presencia de colonias. 3 Recuento de Enterobacterias 3.1 Agregar inmediatamente a otra placa aproximadamente 15 mL de VRBGA (violet red bile glucose agar), previamente fundido y termostatizado a 45 C. 3.2 Mezclar por rotacin y dejar solidificar a temperatura ambiente. Luego cubrir con una sobrecapa del mismo agar de aproximadamente 5 mL. Dejar solidificar. 3.3 Incubar a 35 2 C durante no ms de 24 h. Examinar para verificar la presencia de colonias tpicas (colonias rojas, con dimetro mayor a 1 mm, habitualmente con halo de bilis precipitada). Reaislar un nmero representativo de colonias tpicas (no menos de cinco) a TSA. Confirmar mediante tincin de Gram y el ensayo de oxidasa. 4 Recuento de hongos y levaduras 4.1 Agregar inmediatamente a la placa restante 15 a 20 mL de SDA (agar glucosado de Sabouraud) con cloranfenicol, previamente fundido y termostatizado a 45 C. 4.2 Mezclar por rotacin cada placa y dejar solidificar a temperatura ambiente. 4.3 Incubar a 25 2 C durante 5 a 7 das. Examinar para verificar la presencia de colonias tpicas de hongos filamentosos y/o levaduriformes (realizar una coloracin simple).


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5 - BSQUEDAS. 5.1 - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 5.1.1 Pesar aspticamente 10 g de la muestra y agregar a 90 mL de medio TSB. Si fuera necesario homogeneizar mediante suave agitacin. 5.1.2 Incubar 18 a 24 h a 35 2 C. 5.1.3 Realizar el aislamiento a los siguientes medios slidos en placa: MSA (agar manitol sal) o agar Baird Parker para Staphylococcus aureus, agar cetrimida para Pseudomonas aeruginosa y agar Mac Conkey o EMB-Levine (agar eosina azul de metileno-Levine) para Escherichia coli. (Para la bsqueda de Salmonella continuar el procedimiento en 5.2). 5.1.4 Incubar las placas a 35 2 C durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias tpicas. 5.1.5 Si no existen colonias tpicas en los respectivos medios, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli en 10 g de muestra. 5.1.6 Si aparecen colonias tpicas de Staphylococcus aureus en MSA o agar Baird Parker, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Luego tomar colonias de este medio y hacer la coloracin de Gram, el ensayo de catalasa y el ensayo de coagulasa. 5.1.7 Si aparecen colonias tpicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimida, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar la coloracin de Gram, el ensayo de oxidasa y el crecimiento a 42 0,5 C en TSB. Si fuese necesario confirmar la produccin de pigmento piocianina en agar King A (incubar no menos de 3 das a 35 2 C o a temperatura ambiente). 5.1.8 Si aparecen colonias tpicas de Escherichia coli en agar Mac Conkey o EMB-Levine, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar una coloracin de Gram, el test de catalasa, oxidasa y realizar el ensayo de IMViC (indol, rojo de metilo-Voges Proskauer, citrato)

Descripcin de colonias tpicas de Staphylococcus aureus Medio Agar manitol sal Agar Baird-Parker Descripcin de colonias tpicas Colonias amarillas rodeadas de un halo amarillo Colonias negras, brillantes rodeadas de un halo claro

Descripcin de colonias tpicas de Pseudomonas aeruginosa Medio Agar cetrimida Descripcin de colonias tpicas Colonias castao claro con pigmento verde-azulado que fluoresce al UV y difunde al medio.


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Descripcin de colonias tpicas de Escherichia coli Medio agar Mac Conkey agar EMB (Levine) Descripcin de colonias tpicas Colonias rojas precipitada habitualmente con halo de bilis

Colonias negras habitualmente con brillo metlico verdoso bajo luz reflejada

Pruebas para Staphylococcus aureus Coloracin de Gram: cocos positivos en racimos Fermentacin de manitol: positiva Catalasa: positiva Coagulasa o DNAsa: positiva Pruebas para Pseudomonas aeruginosa Coloracin de Gram: bacilos negativos Oxidasa: positiva Catalasa: positiva Crecimiento a 42 C: positivo King A: pigmento azulado Pruebas para Escherichia coli Coloracin de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos Oxidasa: negativa Catalasa: positiva OF glucosa: fermentativo Indol: Positivo o negativo Rojo metilo: positivo Voges Proskauer: negativo Citrato: negativo 5.2 - Salmonella spp. 5.2.1 Pipetear 0,1 mL del TSB previamente incubado durante 18 a 24 h a un tubo con 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. 5.2.2 Incubar ambos tubos a 35 1 C (el caldo Rappaport-Vassiliadis puede incubarse a 41,5 1 C) por no ms de 24 h. 5.2.3 De ambos tubos realizar aislamiento a XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) y a por lo menos uno de los siguientes medios slidos en placa: VB (agar verde brillante) y SS (agar Salmonella Shigella). 5.2.4 Incubar las placas a 35 2 C durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias tpicas. 5.2.5 Si no existen colonias tpicas, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Salmonella spp. Si aparecen colonias tpicas en alguno de los medios, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar luego la coloracin de Gram, el ensayo


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de oxidasa, catalasa, TSI, lisina de Meller (o LIA) y ureasa (o fenilalanina). Realizar una identificacin mas completa con sistemas de identificacin apropiados y confirmar con el uso de antisueros polivalentes de Salmonella.

Descripcin de colonias tpicas de Salmonella spp* Medio Agar xilosa lisina desoxicolato Agar verde brillante Agar Salmonella Shigella Descripcin de colonias Colonias rojas con o sin centro negro Colonias blancas o rosadas, pequeas, transparentes, con halo rojizo Colonias incoloras o castaas con o sin centro negro de lactosa pueden dar colonias con

*algunas cepas de Salmonella fermentadoras caractersticas diferentes a las descritas

Pruebas para Salmonella spp Coloracin de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos Oxidasa: negativa Catalasa: positiva TSI: alcalino/cido con o sin produccin H2S, con o sin gas Ureasa y fenilalanina: negativa Lisina Meller: positiva. LIA: pico alcalino/fondo alcalino con o sin produccin de H2S


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ESQUEMA DE BUSQUEDA DE SALMONELLA

10 g muestra + TSB35 C 24 h 0,1 mL 1 mL

PREENRIQUECIMIENTO

Caldo Rappaport

Caldo tetrationato 41,5 C 24 h

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

35 C 24 h

Agar VB 35 C 24 h 35 C 24 h

Agar XLD

AISLAMIENTO SELECTIVO

Colonias no tpicas

Colonias tpicas

AUSENCIA de Salmonella sp en 10 g

Reaislamiento de varias coloniasIDENTIFICACION Confirmacin con pruebas bioqumicas y serolgicas


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RECUENTO DE HETEROTRFICOS POR EL MTODO DE MEMBRANA FILTRANTE 1 - Definiciones 1.1 Bacterias heterotrficas. Se considera a las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, mesfilas y psicrotrficas, capaces de crecer en un medio de agar nutritivo. 1.2 Filtro de membrana. Es un elemento de filtracin, delgado, no fibroso, para lquidos y gases, de acetato o nitrato de celulosa que tiene un tamao de poro medio de 0,45 micras de dimetro, en donde las partculas de mayor tamao que el del poro son retenidas sobre la superficie cuando se aplica succin o presin. No debe contener sustancias inhibitorios del crecimiento bacteriano.

2 - Procedimiento 2.1 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 2.2 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiolgico (SF) u otro diluyente apropiado (dilucin 1/10 o 10-1). 2.3 Pipetear 1 mL de la dilucin resultante en un frasco con 10 a 50 mL de suero fisiolgico, de manera de mojar toda la superficie de la membrana. 2.4 Filtrar el total del volumen resultante (correspondiente a 0,1 mL de la muestra original) por embudo de filtracin equipado con filtro de membrana estril bajo vaco parcial. 2.5 Enjuagar el embudo con tres porciones de 50 mL de suero fisiolgico. 2.6 Colocar la membrana cuidadosamente sobre el medio slido en placa de Petri (PCA o TSA), evitando la formacin de burbujas. 2.7 Incubar a 35 2 C por 48 h. 2.8 Contar las colonias en los filtros de membrana. La densidad ptima de colonias por filtro es entre 20 y 200.


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RECUENTO DE COLIFORMES FECALES EN AGUA DE PLAYA POR NMP. 1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales 1.1 Colocar en una gradilla nueve tubos con medio caldo lauril triptosa (CLT) simple concentracin con campana de Durham, para hacer la serie (3-3-3). 1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 1.3 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiolgico (SF) u otro diluyente apropiado (dilucin 1/10 o 10-1). 1.4 Con una pipeta de 1 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de tres tubos con medio de simple concentracin (primera serie), 0,1 mL de la muestra (o 1 mL de la dilucin 1/10) en otros tres tubos (segunda serie) y 0,1 mL de la dilucin 1/10 (equivalente a 0,01 mL de la muestra) en otros tres tubos (tercer serie). Rotular adecuadamente los tubos con la dilucin sembrada 1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitacin suave. 1.6 Incubar los tubos a 35 0,5 C. Luego de 24 2 h agitar los tubos suavemente y observar. 1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al crecimiento bacteriano y gas en la campana. 1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h.

2 - Ensayo de coliformes fecales 2.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC. 2.2 Incubar en bao de agua a 44,5 0,2 C por 24 2 h. 2.3 Considerar tubos positivos a los que presentan crecimiento y produccin de gas a las 24 h. 2.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del nmero de tubos positivos del medio EC.

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE POR NMP. 1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales 1.1 Colocar en una gradilla tres tubos con medio CLT doble concentracin, y seis tubos con medio CLT simple concentracin, para hacer la serie (3-3-3). Todos los tubos deben tener campana de Durham. 1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 1.3 Con una pipeta de 10 mL estril sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tres tubos con medio de doble concentracin. 1.4 Con una pipeta de 1 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en tres tubos con medio de simple concentracin y 0,1 mL de la muestra en los otros tres tubos. Rotular adecuadamente los tubos. 1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitacin suave. 1.6 Incubar los tubos a 35 0,5 C. Luego de 24 2 h agitar los tubos suavemente y observar.


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1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al crecimiento bacteriano y gas en la campana. 1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h. 2 - Ensayo confirmativo de coliformes totales 2.1 Someter a la prueba confirmativa todos los tubos que a las 24 48 h presenten reaccin positiva presuntiva. Si esta reaccin positiva aparece a las 24 h, es conveniente pasar a la confirmacin sin dejar transcurrir las 48 h. 2.2 Agitar suavemente los tubos. 2.3 Subcultivar por medio de un ansa de cada tubo con resultado positivo presuntivo a un tubo con medio caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) con campana de Durham. Rotular todos los tubos adecuadamente. 2.4 Incubar los tubos de CLBVB por 48 3 h a 35 0,5 C. 2.5 La produccin de gas constituye un resultado positivo confirmado. 2.6 Calcular el valor de NMP de coliformes totales confirmados a partir del nmero de tubos positivos del medio CLBVB. 3 - Ensayo de coliformes fecales 3.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC. 3.2 Incubar en bao de agua a 44,5 0,2 C por 24 2 h. 3.3 Considerar tubos positivos a los que presentan produccin de gas a las 24 h. 3.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del nmero de tubos positivos del medio EC.


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COMPOSICIN DE MEDIOS A EMPLEARSUERO FISIOLGICO Cloruro de sodio Agua

8,5 g 1L

TSA (agar tripticasa soja) Digerido Pancretico de Casena Digerido Papanico de Harina de Soja Cloruro de Sodio Agar Agua

15,0 g 5,0 g 5,0 g 15,0 g 1L

TSB (caldo tripticasa soja) Digerido Pancretico de Casena Digerido Papanico de Harina de Soja Cloruro de Sodio Fosfato Dibsico de Potasio Glucosa Agua

17,0 g 3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5 g 1L

SDA (agar Sabouraud glucosado) Glucosa Digerido pptico de tejido animal Digerido pancretico de casena Agar Agua

40 g 5g 5g 15 g 1L

Agregar antes de esterilizar 50 mg de cloranfenicol por litro de medio pH despus de la esterilizacin: 5,6 0,2. ALRF (Agar Rojo Fenol Base + lactosa) Digerido pancretico de casena Cloruro de Sodio Agar Rojo Fenol Lactosa Agua pH final: 7,4 0,2

10 g 5,0 g 15 g 0,018 g 10 g 1L

VRBGA (violet red bile glucose agar) Peptona Extracto levadura Cloruro de sodio Sales biliares Glucosa Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua

7,0 g 3,0 g 5,0 g 1,5 g 10,0 g 0,03 g 2 mg 15,0 g 1L


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AGAR BAIRD PARKER Digerido Pancretico de Casena Extracto de Carne Vacuna Extracto de Levadura Cloruro de Litio Agar Glicina Piruvato de Sodio Agua

10,0 g 5,0 g 1,0 g 5,0 g 20,0 g 12,0 g 10,0 g 1L

Esterilizar y dejar enfriar a una temperatura entre 45 y 50 C. Agregar 10 mL de solucin estril de telurito de potasio (1 en 100) y 50 mL de emulsin de yema de huevo. Mezclar

MSA (agar manitol sal) Digerido Pancretico de Casena Digerido Pptico de Tejido Animal Extracto de Carne Vacuna D-Manitol Rojo de Fenol Cloruro de Sodio Agar Agua

5,0 g 5,0 g 1,0 g 10,0 g 25 mg 75,0 g 15,0 g 1L

AGAR CETRIMIDA Digerido Pancretico de Gelatina Cloruro de Magnesio Sulfato de Potasio Bromuro de Cetiltrimetilamonio (Cetrimida) Glicerina Agar Agua

20,0 g 1,4 g 10,0 g 10 mL 13,6 g 1L 0,3 g

EMB LEVINE (agar eosina azul de metileno Levine) Digerido Pancretico de Gelatina 10,0 g Fosfato Dibsico de Potasio 2,0 g Lactosa 10,0 g Eosina Y 400 mg Azul de Metileno 65 mg Agar 15,0 g Agua 1L

AGAR MAC CONKEY Digerido Pancretico de Gelatina Digerido Pancretico de Casena Digerido Pptico de Tejido Animal Lactosa Rojo Neutro Mezcla de Sales Biliares Cloruro de Sodio Cristal Violeta Agar Agua

17,0 g 1,5 g 1,5 g 10,0 g 30 mg 1,5 g 5,0 g 1,0 mg 13,5 g 1L


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CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS Peptona de soja Cloruro de magnesio hexahidratado Cloruro de sodio Fosfato dibsico de potasio Fosfato monobsico de potasio Verde de malaquita Agua

4,5 g 29,0 g 8,0 g 0,4 g 0,6 g 0,036 g 1L

CALDO TETRATIONATO Digerido Pancretico de Casena Digerido Pptico de Tejido Animal Sales Biliares Carbonato de Calcio Tiosulfato de Sodio Agua

2,5 g 2,5 g 1,0 g 10,0 g 30,0 g 1L

Calentar la solucin de los slidos a ebullicin. En el da de su utilizacin, agregar una solucin de 5 g de yoduro de potasio y 6 g de yodo en 20 mL de agua. A continuacin, agregar 10 mL de una solucin de verde brillante (1 en 1000) y mezclar. No se debe calentar el medio despus de agregar la solucin de verde brillante. AGAR XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) L-Lisina Xilosa Lactosa Sacarosa Rojo de Fenol Cloruro de Sodio Extracto de Levadura Desoxicolato de Sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Frrico Amnico Agar Agua pH final: 7,6 0,2 AGAR SALMONELLA SHIGELLA Extracto de carne Peptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Verde brillante Rojo neutro Agar Agua

5,0 g 3,5 g 7,5 g 7,5 g 80 mg 5,0 g 3,0 g 2,5 g 6,8 g 800 mg 13,5 g 1L

5,0 g 5,0 g 10,0 g 8,5 g 8,5 g 1,0 g 0,33 mg 25 mg 13,5 g 1L 8,5 g


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AGAR VERDE BRILLANTE Extracto de Levadura Digerido Pptico de Tejido Animal Digerido Pancre tico de Casena Lactosa Cloruro de Sodio Sacarosa Rojo de Fenol Agar Verde Brillante Agua CLT (caldo lauril sulfato triptosa) Triptosa Lactosa Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Lauril sulfato de sodio Agua CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante) Peptona Bilis vacuna Lactosa Verde brillante Agua Caldo EC Triptosa Lactosa Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Sales biliares Agua PCA (agar para recuento en placa) Triptona Extracto de levadura Glucosa Agar

3,0 g 5,0 g 5,0 g 10,0 g 5,0 g 10,0 g 80 mg 20 g 12,5 mg 1L

20,0 g 5,0 g 2,75 g 2,75 g 5,0 g 0,1 g 1L

10,0 g 20,0 g 10,0 g 13,3 mg 1L

20,0 g 5,0 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1,5 g 1L

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g


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TERCER CICLO Durante el tercer ciclo (2 clases) se har el estudio de agentes fsicos, qumicos y biolgicos sobre los m.o. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de: 1) Disear un ensayo para evaluar la accin de un agente antimicrobiano 2) Comprender el uso de la escala de Mac Farland 3) Calcular el tiempo de reduccin decimal de un agente antimicrobiano 4) Calcular la CIM de un antibitico para una cepa dada Clase 1 2 Trabajo experimentalCurva de muerte de E. coli a 63 C. Clculo de D. Evaluacin de desinfectantes. Ensayo de difusin de antibiticos y extractos. Calcular la CIM para un antibitico y una cepa dadas Lectura y discusin de resultados

Material a estudiarRecuentos: determinacin de la masa celular, turbidimetra, escala de Mac Farland. Control del crecimiento microbiano. Agentes fsicos, qumicos y biolgicos

ESTUDIO DE AGENTES Se evaluar el calor como agente fsico frente a una cepa de E. coli. Se realizar el clculo del tiempo de reduccin decimal en suero fisiolgico a 63 C. Se evaluar la accin del hipoclorito (250 ppm u otras) con y sin sustancias interferentes y del etanol 70% sobre una cepa de Staphylococcus aureus, segn la norma europea (modificada) EN 1276:1997: Antispticos y desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de suspensin para la evaluacin de la actividad bactericida de los antispticos y desinfectantes qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1). Segn esta norma, un desinfectante debe ser capaz de reducir por lo menos en 5 rdenes la carga microbiana inicial, luego de 5 minutos de contacto a 20 C. Para realizar el recuento despus del contacto con el agente, es necesario eliminar todo efecto inhibidor del agente, ya que su presencia puede falsear el resultado. Para ello se pueden usar diferentes mtodos: dilucin, neutralizacin o filtracin. Para el caso del hipoclorito se usar tiosulfato de sodio al 10% como neutralizante, para el caso del etanol se utilizar filtracin por membrana para eliminar el agente.


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1 Agentes Fsicos: calor 1.1 Preparar una suspensin de Escherichia coli (ATCC 25922) en suero fisiolgico, equivalente al tubo Mac Farland N4, a partir de un cultivo en tubo inclinado en TSA. 1.2 Homogeneizar bien la suspensin en vortex. 1.3 Sacar una alcuota y realizar las diluciones necesarias en suero fisiolgico. 1.4 Realizar el recuento en superficie en placas de TSA secas sembrando tres diluciones sucesivas. Extender con rastrillo estril y dejar adsorber unos 15 min. 1.5 Incubar durante 24 h a 35 2 C. 1.6 Colocar el resto de la suspensin en bao de agua a 63 C. y comenzar a registrar el tiempo transcurrido. 1.7 Extraer a distintos tiempos alcuotas de 1,5 mL a un tubo vaco estril y enfriar inmediatamente en bao de hielo. 1.8 Realizar el recuento de viables de las alcuotas extradas a los distintos tiempos sembrando las diluciones necesarias en superficie en placas de TSA. Extender con rastrillo estril y dejar adsorber unos 15 min. 1.9 Incubar durante 24 h a 35 2 C. 2.0 Construir tabla de N de m.o. sobrevivientes en funcin del tiempo y la correspondiente grfica de log N de sobrevivientes en funcin del tiempo. 2.1 Calcular el valor D. Nota: sabiendo que el tiempo D a 63 C en TSB para E. coli ATCC 25922 es de 0,7 minutos, determinar los tiempos y las diluciones necesarias para construir la curva de muerte para el mismo m.o. en suero fisiolgico.

2 Evaluacin de Desinfectantes 2.1 Hipoclorito de sodio 2.1.1 Preparar una suspensin de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiolgico, equivalente al tubo Mac Farland N4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA. 2.1.2 Homogeneizar bien en vortex. 2.1.3 Tomar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico y agregar a 9,0 mL de agua destilada estril. Esta suspensin es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensin Ni representa el valor a tiempo cero. 2.1.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solucin de hipoclorito de sodio 250 ppm. Luego agregar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico. 2.1.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 C (ambiente) durante 5 minutos. Esta suspensin es Nf. 2.1.6 Tomar luego 1 mL de esta suspensin y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solucin de neutralizante. 2.1.7 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensin en una placa de Petri estril. 2.1.8 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 C. 2.1.8 Comparar el resultado del recuento obtenido para Ni y Nf (luego del contacto durante 5 minutos con el agente).


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2.2 Hipoclorito de sodio con sustancias interferentes 2.2.1 Agregar 1,0 mL de sustancia interferente (p. ej. leche descremada diluida) a un tubo con 8,0 mL de solucin de hipoclorito de sodio 250 ppm (u otra concentracin elegida). Homogeneizar bien. 2.2.2 Agregar 1 mL de la suspensin de S. aureus preparada en 2.1.2 en suero fisiolgico. Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 C (ambiente) durante 5 minutos. 2.2.3 Tomar luego 1 mL de esta suspensin y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solucin de neutralizante. 2.2.4 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensin en una placa de Petri estril. 2.2.5 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 C. 2.2.6 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.1.3) y Nf, luego de 5 minutos con el agente y la sustancia interferente.

ESQUEMA PARA HIPOCLORITO DE SODIOEnsayo8 mL desinf + 1 mL agua (o sust. interf.)

Susp Mac Farland N4 1 mL 1 mL

Ni t=09 mL de agua destilada 5 min. 1 mL

Nf t=5 min

1 mL Diluciones en SF

9 mL neutralizante

1 mL

Recuento en placa TSA


Calcular el efecto de reduccin decimal o efecto germicida EG: Log Ni Log Nf donde Ni es el resultado del recuento obtenido para el Ni a tiempo cero (1/10 del valor de la suspensin McFarland N4) y Nf es el resultado del recuento obtenido en la suspensin luego del contacto con el agente (calcular el recuento en contacto con el agente corrigiendo segn las diluciones sembradas).


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2.3 Etanol 2.3.1 Preparar una suspensin de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiolgico, equivalente al tubo Mac Farland N4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA. 2.3.2 Homogeneizar bien en vortex. 2.3.3 Tomar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico y agregar a 9,0 mL de agua destilada estril. Esta suspensin es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensin Ni representa el valor a tiempo cero. 2.3.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solucin de etanol al 70% (u otra concentracin). Luego agregar 1 mL de la suspensin de S. aureus en suero fisiolgico. 2.3.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 C (ambiente) durante 5 minutos. Esta suspensin es Nf. 2.3.6 Tomar inmediatamente 1 mL de esta suspensin y agregar a 50 mL de suero fisiolgico 2.3.7 Homogeneizar y filtrar 5 mL mediante embudo con membrana aplicando vaco. 2.3.8 Enjuagar la membrana con dos porciones de 50 mL de suero fisiolgico 2.3.9 Colocar la membrana sobre placa de TSA. 2.3.10 Incubar a 35 2 C por 48 h. 2.3.11 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.3.3) y Nf, luego de 5 minutos en contacto con el agente.

ESQUEMA PARA ETANOL

Susp Mac Farland N4 1 mL 1 mL

Ensayo9 mL etanol

Ni t=09 mL de agua destilada 5 min. 1 mL

Nf t=5 min

1 mL

Diluciones en SF

50 mL SF

FILTRAR Y ENJUAGAR Recuento en placa TSA

5 mL


Calcular el efecto de reduccin decimal o efecto germicida EG: Log Ni Log Nf


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Controles A) Efecto bactericida del neutralizante Tomar 1 mL de la suspensin Ni (preparada en 2.1.3) de S. aureus y agregar a 9,0 mL de solucin neutralizante. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Realizar el recuento de esta suspensin en TSA incorporado (realizar las diluciones adecuadas en SF). Verificar que la solucin neutralizante no ejerce efecto bactericida sobre la cepa ensayada. B) Validacin de la neutralizacin Tomar 1 mL de agente desinfectante y agregar a 9 mL de solucin neutralizante, mezclar bien. Tomar luego 0,1 mL de una dilucin de la suspensin S. aureus (preparada en 2.1.1) de concentracin conocida (que contenga alrededor de 1000 clulas en el volumen a agregar) a esta solucin. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Sembrar 1 mL de esta suspensin en una placa de Petri estril y agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 C. Comparar el resultado obtenido con el recuento de la suspensin conocida de S. aureus de alrededor de 1000 clulas. Verificar que el neutralizante es efectivo para neutralizar el antisptico a la concentracin ensayada.

3 Evaluacin de agentes biolgicos 3.1 Ensayos de difusin. 3.1.1 Prepara una suspensin del m.o. ajustada al 0.5 de la escala de Mc Farland. 3.1.2 Hisopar la superficie de dos placas de agar Mueller Hinton. 3.1.3 Colocar cuidadosamente sobre la superficie de una placa -a una distancia de 1,5 mm entre s y del borde de la placa- discos de antibiticos de concentracin conocida. 3.1.4 Colocar sobre la superficie de la otra placa 4 cilindros de metal. Cargar los cilindros con 100 L de las soluciones de antibiticos y extractos. 3.1.4 Incubar a 35 C durante 18 a 20 h. 3.1.5 Leer los halos de inhibicin. 3.2 Ensayo de dilucin en medio lquido. Determinacin de la concentracin inhibitoria mnima. 3.2.1 Preparar una suspensin del m.o. en un tubo conteniendo 4.5 mL de caldo Mueller Hinton, a partir de un cultivo de 18 h y ajustar la turbidez a 0,5 de Mac Farland. 3.2.2 Realizar dos diluciones seriadas de 1: 10 en caldo Mueller Hinton (para alcanzar una concentracin de 1 x 106 ufc/mL) (Inculo). 3.2.3 Transferir 1 mL de la suspensin bacteriana de 1x106 ufc/mL a cada uno de los tubos conteniendo 1mL de dilucin del antibitico y al tubo control. Rotular los tubos con la concentracin final de antibitico. 3.2.4 Incubar los tubos inoculados conteniendo las diferentes concentraciones de antibitico y el tubo control de crecimiento a 35 C, durante 16-20 h. 3.2.5 Determinar la C.I.M.


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NORMAS

BSICAS

DE

SEGURIDAD

EN

UN

LABORATORIO

DE

MICROBIOLOGA

1. Esta prohibido, comer, beber, fumar, tomar mate, almacenar alimentos, aplicarse cosmticos y cambiarse lentes de contacto en el rea de trabajo. Los lentes de contacto solo se deben utilizar cuando no se puedan usar otro tipo de lentes. 2. Est prohibido pipetear con la boca. 3. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospeche contacto con material contaminado. 4. Se debe trabajar de manera tal de minimizar la creacin de aerosoles. 5. Se debe usar tnica y esta debe estar abrochada. 6. El pelo largo se debe usar atado. 7. Cuando sea necesario se debe usar lentes de seguridad para proteger la cara de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones. 8. El laboratorio se debe mantener ordenado y limpio. Se debe minimizar el material que no sea pertinente al trabajo en las mesadas. 9. Todo material contaminado se debe descontaminar antes de desechar. 10. Las superficies de trabajo se deben limpiar y descontaminar con desinfectantes adecuados al final del trabajo y en caso de haberse volcado material contaminado. 11. Todos los accidentes o vuelcos de material deben ser comunicados al docente encargado de grupo.


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UTILIZACIN DEL MICROSCOPIO

1. Colocar una preparacin. 2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al mximo. 3. Abrir el diafragma del condensador al mximo y llevar el condensador al mximo de su trayectoria. 4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x. 5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable. 6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. 7. Enfocar la preparacin. 8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal. 9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polgono se vean ntidos. 10. Ajustar el enfoque. 11. Si la imagen poligonal no est en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador. 12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo ms. No tocar ms la altura del condensador. 13. Elegir el contraste ptimo ajustando el diafragma del condensador. 14. Verificar la iluminacin quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el diafragma a 2/3 abierto (2/3 del campo iluminado). 15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador. Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del condensador a la apertura del objetivo.

MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa) Limpiar el aceite de inmersin de lentes y otras superficies del microscopio con papel tissue. El aceite de inmersin debe conservarse cerrado. Apagar la fuente de luz del microscopio Cubrir el microscopio con su funda.


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CITOLOGA Y MORFOLOGA DE BACTERIAS

Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos (m.o.). El trmino microorganismo no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (< 0,1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre s. Por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque sean todos microscpicos. En una escala comparativa tenemos: Protozoarios > levaduras > bacterias > virus Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes: elipsoidal o esfrica cilndrica o en forma de bastn espiral o helicoidal Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin celular. As tenemos: cocos en pares (diplococos), ej. Neisseria cocos en cadena, ej. Streptococcus cocos en racimo, ej. Staphylococcus cocos en ttradas, ej. Pediococcus cocos en cubos, ej. Sarcina cocos sin distribucin especial Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES (rod en ingls) y presentan otros modelos de agrupacin. As tenemos: bastones en cadena, ej. Bacillus bastones en letras chinas o empalizadas, ej. Corynebacterium bastones sin distribucin especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.

OBSERVACIN Y EXAMEN MICROSCPICO La observacin y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales: observando los microorganismos vivos sin teir observando las clulas fijadas, teidas con colorantes Las bacterias vivas en suspensin acuosa tienen propiedades pticas similares a las del agua y, por lo tanto, son difciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se las tien con un colorante adecuado. Sin embargo, para muchos fines es preferible evitar la coloracin debido a que puede alterar la forma y adems mata a las clulas. Si se quiere observar los m.o. vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste de fases o en su defecto un microscopio de campo claro con iluminacin mnima. sta se logra bajando el condensador, minimizando la iluminacin.


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El movimiento de traslacin de algunas bacterias puede observarse en preparaciones hmedas del material, es decir con los m.o. vivos. Debe distinguirse claramente el movimiento independiente de las bacterias mviles del movimiento por arrastre por corrientes de conveccin y el movimiento browniano. Cuando el movimiento se realice por propulsin flagelar, el tipo de movimiento variar con la disposicin de los flagelos en el cuerpo celular. La coloracin de las bacterias tiene como fines: poder visualizarlas para determinar morfologa y tamao. diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes. revelar la presencia de distintas estructuras internas. Los colorantes utilizados son sales en las que el anin o el catin es el responsable del color; en el primer caso se trata de un colorante cido o aninico y en el segundo, bsico o catinico. Cuando el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad la clula bacteriana tiene una dbil carga negativa. Como la diferencia de carga elctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y la clula, las bacterias tendrn afinidad por los colorantes bsicos (ej.: cristal violeta y azul de metileno). Cuando se utiliza un solo colorante bsico, el mtodo se denomina coloracin simple, mientras que cuando se usan dos o ms se llama coloracin compuesta. La coloracin diferencial es un caso particular de coloracin compuesta. Cuando a una preparacin bacteriana se le aplica un colorante cido tal como eosina, ste no se une a las clulas cargadas negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando as un fondo coloreado donde contrastan las clulas incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tincin y se denomina tincin negativa o indirecta. En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna sustancia que contribuya a la fijacin del colorante a la clula, por ejemplo: cido tnico, sales de Al, Fe, etc.

PREPARACIN DE UN FROTIS Comprende las siguientes etapas: 1) extendido del material en un portaobjetos 2) secado 3) fijacin El propsito de la fijacin es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la clula y adherir la preparacin al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijacin se lavara la capa de clulas durante el proceso de tincin. El agente fijador ideal preserva las estructuras de la clula con su forma y posicin sin que aparezcan estructuras que no existan en la clula original. El calor es en general el mtodo de fijacin mas utilizado para la observacin de la morfologa de clulas bacterianas. Cuando adems de los microorganismos interesa la observacin de clulas animales, se utiliza un mtodo qumico como la fijacin por metanol y por formol, que altera menos que el calor la morfologa de las clulas. Coloracin simple Consiste en la aplicacin de un colorante luego de fijada la preparacin. Pueden emplearse los siguientes colorantes bsicos: azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicacin sern distintos. Coloracin de Gram Los m.o. difieren fsica y qumicamente entre s y por eso reaccionan de una manera diferente frente a un determinado proceso de tincin. Esto constituye el fundamento de las tinciones diferenciales. La tincin de Gram, la ms empleada en bacteriologa, es una coloracin diferencial. Por este mtodo se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram ), en funcin de su reaccin frente a la coloracin.


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Las clulas previamente fijadas se tien con solucin de cristal violeta, se lavan y se tratan con lugol. El yodo del lugol forma un complejo con el cristal violeta que sirve para fijar ste a la clula. Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o mezclas de ambos) en el cual el complejo yodo-cristal violeta es soluble. Algunos microorganismos son decolorados (los Gram ) mientras que otros no (los Gram +). Luego de la decoloracin se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visibles las bacterias Gram que haban sido decoloradas. Las bacterias Gram + se ven de color azulvioleta y las Gram se ven rosadas. Las bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, que cuando se deshidratan por el alcohol provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo yodo-cristal violeta se escape. En las bacterias Gram , la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje del solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la clula. Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composicin qumica totalmente diferente, generalmente se tien como Gram +. En este caso no son los constituyentes qumicos, sino la estructura fsica de la pared lo que le confiere su coloracin como Gram +. Coloracin de cido resistentes La tincin de cido-resistentes es una tincin diferencial que demuestra la resistencia de la clula a ser decolorada por los lcalis, cidos y alcohol. En algunos microorganismos de los gneros Mycobacterium y Actinomyces la propiedad cido resistente est relacionada con su alto contenido en lpidos.

Coloracin de estructuras Esporas Ciertas especies bacterianas, en particular de los gneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro de la clula, a razn de una por clula. A diferencia de la clula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes qumicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos perodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar. Tambin puede inducirse esa germinacin mediante, por ejemplo, un shock trmico, es decir un calentamiento a 80C. Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las tcnicas de coloracin comunes aparecern como regiones sin teir dentro de las clulas coloreadas. Por lo tanto, para teir las esporas especficamente, deben usarse mtodos de coloracin especiales. Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloracin son: presencia o ausencia de esporas deformacin o no del cuerpo celular posicin dentro del cuerpo celular

En base a la posicin de la espora dentro de la clula se las clasifica en: terminales, centrales y subterminales (posicin intermedia). Flagelos Muchas bacterias son mviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apndices largos, delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la clula por otro. Son tan delgados que solo se pueden ver al microscopio comn luego de una coloracin especial que hace uso de un mordiente. Este promueve la fijacin de las molculas de colorante al flagelo dando lugar a la formacin de un precipitado a lo largo del flagelo, hacindolo visible. La clula bacteriana puede tener uno o ms flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en: polar (flagelo en un extremo del cuerpo celular), anfitrica (flagelos en ambos


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extremos), lofotrica (penacho de flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda la clula sin distribucin). Cpsula Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacridos, polipptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cpsula. La mejor forma de observarla es con tincin negativa, aunque existen tcnicas especiales, para la coloracin especfica de la cpsula.


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TCNICAS

MANIPULACIN ASPTICA DE CULTIVOS Tomar el tubo de cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el tapn est libre, girndolo sin destapar. Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar, ndice y mayor, dejando libres el anular y el meique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono fro de la llama del mechero, en posicin vertical y luego ir levantndola hasta que quede toda al rojo. Pasar el ansa por la llama en un ngulo de 60 con la vertical, mantenindola siempre en posicin paralela al cuerpo. Flamear el metal adyacente al ansa. Trabajando cerca del mechero, tomar el tapn de algodn del tubo con los dedos anular y meique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del tubo. Introducir el ansa tocando la pared fra dentro del tubo (sin soltar el tapn de algodn) para que se enfre el ansa y luego introducirla en el cultivo lquido o deslizarla sobre la superficie del cultivo slido de abajo hacia arriba, para tomar las clulas a transferir (inculo). Sacar el ansa as cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo. Transferir el inculo, ya sea a un portaobjetos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar nuevamente el ansa.

Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procederse segn tcnica asptica descrita, con el fin de no introducir contaminacin en el cultivo o en la muestra.

OBSERVACIN DE UN PREPARADO FRESCO (para observar movilidad, forma, etc) Mtodo de la gota pendiente Colocar una gota de muestra usando tcnica asptica en el centro de un cubreobjetos limpio. Invertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresin de una lmina excavada, de manera que no deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresin. Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Observar con el lente seco de mayor aumento. Mtodo de lmina-laminilla Colocar una gota de la muestra usando tcnica asptica sobre un portaobjetos limpio y cubrir con un cubreobjetos. Para prevenir las corrientes de conveccin y el secado de la preparacin, se puede sellar poniendo en los bordes del cubreobjetos vaselina slida o esmalte de uas. Observar igual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visin es mucho mejor.

PREPARACIN DE UN FROTIS 1) Colocar con un ansa una gota de muestra -si es lquida- sobre un portaobjetos limpio. Si la muestra proviene de un cultivo en medio slido, colocar primero una gota de agua sobre el porta, tomar la muestra con el ansa, tocar la gota, quemar el ansa y luego de enfriada, mezclar bien con el agua para lograr una suspensin homognea.


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2) Secar al aire. Puede acelerarse el secado, manteniendo la lmina encima de la llama del mechero a 15 cm o ms de distancia. 3) Fijar. Con el frotis seco, pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fijar. Coloracin simple Preparar un frotis segn la tcnica habitual antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones. Cubrir la preparacin con 2 o 3 gotas de solucin de azul de metileno o de cristal violeta y dejar 1 minuto. Lavar con agua. Secar encima de la llama del mechero. Observar al microscopio con lente de inmersin (100x) y determinar forma, disposicin y relacin de tamaos de las distintas bacterias. Coloracin de Gram (Tcnica de Hucker) Preparar un frotis segn la tcnica antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones. Cubrir con solucin de cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar suavemente con agua de la canilla. Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. Lavar de la misma manera. Cubrir con etanol 95% y dejar 30 seg. moviendo suavemente la lmina. Seguir lavando con etanol hasta que este no arrastre ms colorante. Lavar con agua. Cubrir con solucin de safranina y dejar 15 seg. Lavar y secar. Observar por inmersin. Las bacterias Gram + se vern de color azul-violeta y las Gram - rosadas. Coloracin de esporas Preparar un frotis pasando 10 veces por la llama para fijar. Colocar la lmina sobre una plancha para tinciones. Cubrir con pequeos trozos de papel de filtro, impregnar stos con solucin de verde de malaquita y calentar durante 5 min. con el mechero. Mantener el papel siempre saturado con verde de malaquita mediante agregado de solucin. Lavar suave pero abundantemente con agua. Dar contraste con solucin de safranina durante 30 s. Lavar con agua y secar. Observar por inmersin. Se vern las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con contraste de fases, se puede observar la endospora sin teir como una estructura densa, blanca dentro de la clula. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA La microscopa de fluorescencia se basa en los mismos principios de ptica que la microscopa comn, con diferencias en el manejo y el diseo relacionadas con la generacin y transmisin de longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar, ya sean propios de la muestra o de la coloracin utilizada. Los procesos de excitacin generalmente requieren longitudes de onda cortas, en el UV cercano (lmpara de halgeno-cuarzo, arcos de mercurio, etc.). Las lentes deben ser de algn material (generalmente fluorita) que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersin de ser no fluorescente. Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas, esteroides, porfirinas, etc. Un ejemplo de estudio de bacterias por visualizacin directa de fluorocromos naturales es la observacin de bacterias metanognicas con luz UV. Estas fluorescen con luz UV en preparaciones sin coloracin debido al la presencia de coenzimas fluorescentes F 420 y F 350, relacionadas con el metabolismo del C y la metanognesis. Otros compuestos que fluorescen (rodamina, auramina, fluorescena, colorantes de acridina) se utilizan en distintas tcnicas de tincin; por ejemplo la tincin de microorganismos cido-resistentes con auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo. Tambin se utilizan las tcnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicacin a la muestra, de una solucin de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente; si la muestra tiene el antgeno que se busca, este reaccionar y as se localizar. Tal es el caso, por ejemplo, de la deteccin de Salmonella con anticuerpos marcados con fluorescena.


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CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOS

INTRODUCCIN Los hongos constituyen un grupo muy heterogneo de organismos eucariotas, hetertrofos no fotosintticos y con pared celular. Basndose en la apariencia macroscpica de la colonia se pueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se denominan levaduras; si producen crecimientos areos, velludos, algodonosos o pulverulentos se llaman hongos filamentosos o mohos. Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37C y como hongo filamentoso a 25C. Este fenmeno se denomina dimorfismo. El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser unicelular (en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuesto por hifas y una parte reproductora. Las hifas son tubos que contienen ncleos y citoplasma. Pueden presentar septos (micelio tabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2). Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las levaduras constituyen cadenas de clulas denominadas pseudomicelio (fig.3). Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas de micelio presentes en algunos gneros de Ascomycetes y Basidiomycetes. Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las dos formas de reproduccin en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. El holomorfo tiene a la vez una forma de multiplicacin asexuada, el anamorfo o estado imperfecto y una sexuada, el teleomorfo o estado perfecto. La reproduccin asexuada puede ocurrir por propagacin vegetativa a partir de fragmentos de micelio, o por formacin de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.). La reproduccin sexuada se caracteriza por la unin de dos ncleos que dan lugar a esporas sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.). Los hongos pueden ser homotlicos si poseen en el mismo micelio ncleos complementarios que pueden conjugarse o heterotlicos cuando requieren ncleos provenientes de micelios diferentes. En general la reproduccin asexuada es ms importante para la propagacin de la especie. En muchos hongos la reproduccin sexuada se da solo una vez al ao. Hay un grupo de hongos a los que no se les conoce reproduccin sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de ningn tipo y solo se reproduce por fragmentacin del micelio. ZYGOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio no tabicado, cenoctico. Pueden presentar rganos de fijacin: rizoides, tpicos de Rhizopus. Reproduccin ASEXUADA: Clamidosporas: clulas vegetativas que se rodean de una pared gruesa constituyendo a la vez elementos de resistencia (fig.4) y que luego dan origen al micelio. Esporangiosporas: esporas producidas endgenamente dentro de un esporangio. A veces, como en Mucor sp., el esporangio puede presentar una columela (fig. 5). La columela es una vescula o parte central del esporangio que es continua con el esporangiforo (hifa que genera el esporangio). SEXUADA: Zigotes o zygosporas: cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente est cubierto por espinas, que son formados por la fusin de dos gametangios (fig. 6).


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Ej.: zigote heterotlico: Absidia coerula, zigote homotlico: Mucor baciliformis

ASCOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras. Reproduccin ASEXUADA: Gemacin (o fisin ) en levaduras (fig.7). Conidios formados en conidiforo SEXUADA: Ascosporas contenidas en un asco que se forma frecuentemente por kariogamia de 2 ncleos distintos. Generalmente se forman 8 aunque pueden formarse 2 o 4. Los ascos pueden estar includos o no dentro de un ascocarpo. GRUPO FORMAS DE REPRODUCCION Asexuada Hemiascomycetes gemacin Euascomycetes conidios Sexuada Ascos sin ascocarpo Ascos en ascocarpo cleistotecio peritecio apotecio Fig 8 9 10 11 Ejemplo Saccharomyces Emericella Sordaria Pyronema

BASIDIOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y algunas levaduras. Reproduccin ASEXUADA: crecimiento vegetativo, rara vez forman esporas. SEXUADA: basidiosporas formadas sobre basidios.

DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTI Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras. Se agrupan aqu los hongos a los que no se les conoce forma de reproduccin sexuada. Se presume que stos son estados no sexuados o anamorfos de Ascomycetes (o ms raramente Basidiomycetes) cuyos estados sexuados o teleomorfos no han sido descubiertos. Si se observa el estado sexuado de una especie de Deuteromycetes, ambos estados se transfieren al grupo al que pertenece el teleomorfo. Reproduccin Conidios formados en clulas especializadas, las clulas conidigenas que pueden encontrarse en una hifa especializada: el conidiforo.


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La clasificacin dentro de este grupo se basa en la observacin del aparato conidigeno. La forma en que se produzca la conidiognesis dar lugar a la formacin de conidios solitarios, en racimos o en cadenas. En algunos gneros las clulas conidigenas no se diferencian del resto de la hifa, ej.: Aureobasidium (fig.12). En otros, las clulas conidigenas se alargan denominndose filides, ej.: Penicillium (fig.13), se ramifican, ej. Botrytis (fig.14), o el extremo se dilata, ej.: Aspergillus (fig.15). Algunos gneros forman artrosporas por fragmentacin de la hifa, ej.: Geotrichum (fig.16) y otros clamidosporas. Pueden ser unicelulares o contener dos o ms clulas: macroconidias, ej. Alternaria (fig.17) o Fusarium (fig. 18). Las clulas conidigenas pueden estar contenidas dentro de pycnidios, ej.: Phoma, (fig.19). Los pycnidios son cuerpos de fructificacin globosos, con forma de matraz y poseen una apertura apical llamada ostiolo

PARTE PRCTICA En la identificacin de hongos filamentosos juega un rol muy importante las caractersticas morfolgicas macro y microscpicas. Observacin microscpica El micelio se debe describir segn: su situacin: areo (razante a la superficie o elevado) o profundo su morfologa: velludo, glabro, rugoso, etc. su coloracin produzca o no pigmentos que difundan al medio Se debe tratar de observar las estructuras lo ms intacta posible. Puede observarse directamente la placa de Petri con bajo aumento. Las preparaciones se hacen entre lmina y laminilla. Se coloca en un portaobjeto una gota de solucin aclarante de KOH al 10 % o de una solucin colorante de azul de metileno. Se corta, con el ansa, una pequea porcin del material a estudiar. Para disminuir el dao, se puede utilizar un trocito de cinta adhesiva que se presiona suavemente sobre el cultivo. Se coloca el material o el trozo de cinta en la gota, se cubre con un cubreobjeto y se presiona suavemente. Se observa con bajo aumento. BIBLIOGRAFIA Samson, R.A and col.; "Introduction to Food-Borne Fungi",, 1995. Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544. Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for Microbiology, 1985, cap.46. Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15. Guiraud, J. and Galzy, P.; L'analyze microbiologique dans les industries alimentaires, Editions de L'usine, 1981, cap.2. Alexopoulos,C.J. and Mims, W.; Introduccin a la Micologa, Ed. Universitaria de Buenos Aires, 1977. Moore-Landecker, E.; Fundamentals of The Fungi, 2nd ed., Prentice-Hall, 1982. Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985

FIGURAS DE HONGOS


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Fig. 1 Micelio no tabicado

Fig. 2 Micelio tabicado

Fig. 3 Pseudomicelio

Fig. 4 Clamidosporas

Fig. 6 Zygote

Fig. 5

Fig. 7 Gemacin

Fig. 8 Ascos desnudos Fig. 9 Cleistotecio

Fig. 10 Peritecio

Fig. 11 Apotecio


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Fig. 12 Aureobasidium Fig. 13 Penicillium

Fig. 14 Botrytis

Fig. 15 Aspergillus

Fig. 16 Geotrichum

Fig. 18 Fusarium Fig. 19 Phoma

Fig. 17 Alternaria


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SIEMBRA Y AISLAMIENTO - BSQUEDA

SIEMBRA Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado el medio de cultivo debe incubarse a una temperatura adecuada para el crecimiento de los m.o. La siembra puede realizarse en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estril. Cultivo en medio lquido Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por aparicin de turbidez, formacin de velo o pelcula o sedimento. Cultivo en medio slido Puede ser en tubos con medio slido o placas. Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no daar el agar. Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. Tambin se llama siembra por picadura. Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada. En superficie Se colocan 0,1 mL de la dilucin de la muestra con pipeta estril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estril. Se siembra con un ansa para aislar, como se explica ms adelante. Se siembra con un hisopo. Incorporada Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estril vaca, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo slido fundido y termostatizado a 45C; luego se mueve suavemente la placa para que la muestra se mezcle con el agar y se deja solidificar. En medio slido cada clula viable dar origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino adems para contar y aislar. Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, puede ser necesario diluir la muestra con un diluyente estril como suero fisiolgico.

AISLAMIENTO Aislar es separar un microorganismo a partir de una poblacin que los contiene de varios tipos. En ecosistemas naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro o axnico (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algn procedimiento de aislamiento para separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego as poder identificarlos. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos estn en una proporcin adecuada. Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: a) aislamiento por estras. b) aislamiento por dilucin


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Aislamiento en placa por estras Existen distintas tcnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estras paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el ansa, se estra el resto de la superficie sin sembrar. Aislamiento por dilucin en medio slido Se emplean tanto el mtodo de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra usando suero fisiolgico o algn otro diluyente. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS Para aislar microorganismos anaerobios que son rpidamente destruidos por exposicin al oxgeno, las placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmsfera sin oxgeno. Tambin se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina para evitar el acceso de aire. Con anaerobios ms sensibles al oxgeno, se trabaja en cmaras anaerbicas, o tambin usando la tcnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfra; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de oxgeno mientras el tubo est destapado.

BSQUEDA Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin en una muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado bsqueda, que involucra una primera etapa de aumento del nmero del tipo de microorganismo que se desea aislar. Luego se asla por el mtodo de estras o por dilucin y se identifica. Una bsqueda generalmente implica los siguientes pasos: 1) enriquecimiento 2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales) 3) reaislamiento (medio no selectivo) 4) identificacin El objetivo de la etapa de enriquecimiento es aumentar el nmero del microorganismo que se desea determinar y en algunas ocasiones puede subdividirse en dos: preenriquecimiento y enriquecimiento selectivo. El preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los microorganismos buscados estn debilitados o daados y se usan siempre medios nutrientes lquidos no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando la muestra en medios lquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes qumicos o biolgicos que suprimen el crecimiento de otros m.o. no deseados y permiten el desarrollo en particular del o de los microorganismos buscados. Luego de cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando la tcnica de estras en superficie en medios slidos generalmente selectivos y diferenciales. En estos medios deben examinarse las colonias tpicas para el tipo de m.o. que estamos buscando. Las colonias deben describirse por examen macroscpico en funcin del tamao, la forma, el borde, la elevacin, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy til en la identificacin. En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en un medio no selectivo por el mtodo de estras. Esto se conoce como reaislamiento y es necesario para asegurar la obtencin de un CULTIVO PURO del microorganismo de inters, ya que en los medios


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de aislamiento selectivos puede ocurrir que una colonia caracterstica del m.o. que estamos buscando pueda contener como contaminantes en muy bajo nmero- otros microorganismos que no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer. El examen microscpico de una colonia de un cultivo puro de un microorganismo debe mostrar clulas razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfologa. El informe de una bsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA en los gramos o mL de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento). DESCRIPCIN DE COLONIAS DE BACTERIAS Y LEVADURAS Las colonias de muchos m.o. se pueden describir teniendo en cuenta el tamao, color, superficie, etc. Esta descripcin no incluye hongos filamentosos. Tamao: Grande: dimetro mayor a 1 mm Mediana: dimetro aproximadamente igual a 1 mm Pequea: dimetro menor a 1 mm Color Blanco, Crema, Amarillo limn, Negro, etc Superficie Brillante, Lisa, Granular, Rugosa Consistencia Viscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla) Densidad (con luz a travs de la colonia) Opaca, Transparente, Traslcida FORMA

Puntiforme ELEVACIN

Circular

Filamentosa

Irregular

Rizoide

Lanceolada

Chata MARGEN

Elevada

Convexa

Cpula

Umbonada

Umbilicada

Entero

Ondulado

Lobado

Ondeado

Filamentoso


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MEDIOS DE CULTIVO

GENERALIDADES Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos frente a otros m.o. que los acompaen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubacin (atmsfera, temperatura, pH) considerando las caractersticas fisiolgicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema. Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no interfieran durante el aislamiento de los que s interesan. Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificacin de m.o. es el siguiente:

Fuente de inculo

Caldo de enriquecimiento

Aislamiento

Identificacin

Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo de m.o. y simultneamente minimizar la interferencia de otros: Muestra Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se est buscando debe ser factible de estar presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante. Debemos considerar si es til someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor seleccin se realice en este paso inicial, menos selectivos debern ser los medios de cultivo a utilizar. Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que deseamos aislar est en un bajo nmero, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que favorezca su multiplicacin (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompaantes no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado est en alto nmero, no se necesita realizar un enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio slido adecuado directamente. Medio de cultivo Todo medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una o varias especies microbianas y dar condiciones tales como pH, presin osmtica, oxgeno disuelto, etc. adecuados para el crecimiento. Debemos utilizar una formulacin de los medios de cultivo adecuados al tipo de m.o. a cultivar. En general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos (agregando un inhibidor de la flora acompaante), o utilizando un medio de cultivo restrictivo al incluir un nutriente que slo el m.o. deseado sea capaz de utilizar o utilizando condiciones de incubacin particulares. Debemos utilizar las condiciones de incubacin adecuadas: temperatura, luz, atmsfera (aerobia o anaerobia, atmsfera con concentracin de CO2, etc.). Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son: Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podran quitar todos los compuestos orgnicos para permitir el crecimiento de m.o. auttrofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atmsfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto.


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Fuente de nitrgeno. Generalmente se agrega como sales de amonio o peptonas. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgnica u inorgnica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrgeno, que son capaces de obtener su fuente de nitrgeno del N2 atmosfrico. Fuente de energa. Si no se agrega ningn compuesto capaz de ser utilizado como fuente de energa y se incuba a la luz, slo crecern los m.o. fotosintticos que usan la luz como fuente de energa. Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento (vitaminas, aminocidos, cidos nucleicos, cidos grasos, etc.) segn se necesiten o no.

Peptonas Las peptonas son uno de los constituyentes principales de los medios de cultivo en microbiologa. Se preparan por hidrlisis de protenas y por lo tanto estn constituidas por mezcla de polipptidos, pptidos de diverso peso molecular y aminocidos. Las peptonas de uso microbiolgico son mezcla de varios productos resultantes de la hidrlisis proteica: bases nitrogenadas, sales inorgnicas y trazas de minerales y compuestos varios. Algunas fuentes comunes de peptonas son: carne (fresca, deshidratada o congelada), pescado (fresco o deshidratado), casena, gelatina, protena de soja, microorganismos (levaduras, algas), sangre, albmina de huevo, etc. La hidrlisis puede ser en medio cido o alcalino o a presin superior a la atmosfrica para lograr ms altas temperaturas. Las peptonas resultantes en este proceso tienen en general bajo contenido de vitaminas y aminocidos porque son destruidos en el proceso. Sin embargo la hidrlisis tambin puede ser enzimtica (con papana, pancreatina, pepsina) y es realizada a mas bajas temperaturas, y por lo tanto las peptonas del proceso tienen ms elevado contenido de aminocidos y vitaminas que las de la hidrlisis cida o alcalina. Infusiones y extractos Las fracciones solubles en agua de materiales como hgado, clulas de levadura, extracto de malta y msculo tienen bajo contenido en pptidos pero contienen sustancias valiosas para un medio de cultivo como vitaminas, metales traza y carbohidratos complejos. Ejemplos de ellos son los extractos de carne (ricos en compuestos nitrogenados, vitaminas, aminocidos), levadura (ricos en vitaminas del complejo B, aminocidos y compuestos carbonados y nitrogenados), malta (rica en carbohidratos, especialmente maltosa y otros nutrientes) y corazn de buey. Segn la finalidad del medio de cultivo podemos encontrar distintos tipos: 1) Medios nutrientes (no selectivos) Son medios de propagacin que permiten el desarrollo de varios tipos de microorganismos. No contienen inhibidores. Como ejemplos de medios nutrientes comunes tenemos agar nutriente, agar tripticasa soja, caldo nutriente, etc. A veces estos medios se enriquecen con ciertos productos tales como sangre, yema de huevo, etc. para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes: tendramos entonces un medio de cultivo rico o enriquecido; ej. agar sangre, agar chocolate (el medio contiene sangre hemolizada). Tambin pueden contener indicadores de pH u otros para diferenciar la reaccion de los m.o.; tales medios se llamaran medios diferenciales, por el. agar lactosa rojo fenol (indicador de pH rojo fenol), caldo tioglicolato (indicador de potencial redox resazurina). 2) Medios selectivos o inhibitorios Son medios que contienen adems de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide. Estos medios tambin pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos de microorganismos que puedan crecer en l; tal medio sera selectivo y diferencial, por ej. Mac Conkey, Baird Parker, EMB, etc. Los medios de enriquecimiento selectivo son medios selectivos


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lquidos que contienen inhibidores, ej., sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio, etc. 3) Medios diferenciales Contienen sustancias que permiten diferenciar las distintos tipos de m.o. por ej por sus propiedades bioqumicas (produccin de cido de un carbohidrato, produccin de pigmentos, hidrlisis de un compuesto, etc) , ej: agar lactosa rojo fenol, agar Mac Conkey, agar Baird Parker (contiene yema de huevo que permite ver la produccin de lipasas). Pueden ser selectivos o no. Para referirse a otras generalidades de los medios de cultivo, sus constituyentes, preparacin en el laboratorio, control de calidad y almacenamiento se pueden consultar los manuales de medios de cultivo comerciales Preparacin de medios de cultivo Cuando el medio va a repartirse en placas, se esterilizan por separado el medio de cultivo (generalmente por autoclavado) y las placas de Petri (en horno); luego el medio termostatizado a 45 C se reparte en placas, usando tcnica asptica. Cuando el medio va a repartirse en tubos, se reparte antes de su esterilizacin, colocando en cada tubo un determinado volumen segn el tamao del tubo y si queremos o no que quede fondo. Cada tubo se tapa con algodn (o tambin con capuchn de metal, plstico o tapn de rosca). Cuando alguno de los constituyentes del medio de cultivo es termolbil se esteriliza por filtracin y se agrega al medio base luego de autoclavado. Esterilizacin de material de vidrio: Placas de Petri: se preparan en paquetes de 8 a 10 placas segn el tamao, envolvindolas con papel. Tubos: se tapa cada uno con un tapn de algodn y se envuelven con papel en paquetes Pipetas: se coloca un algodn en la parte superior de la pipeta y se envuelve con papel. Se esterilizan en horno a 160 (2 h) o a 180 C (1 h).


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CARACTERSTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO

Medio de cultivo ALRF (agar lactosa rojo fenol) Agar Cetrimide Agar Mac Conkey VRBA (violeta rojo bilis agar) Manitol Salt Agar (Chapman) XLD agar (xilosa lisina desoxicolato) Baird Parker agar TSB + 10% NaCl Caldo Tetrationato CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)

Tipo de medio diferencial (no selectivo) selectivo selectivo y diferencial selectivo y diferencial selectivo y diferencial selectivo y diferencial selectivo y diferencial enriquecimiento selectivo enriquecimiento selectivo enriquecimiento selectivo

Agente bacteriosttico ----bromuro de cetiltrimetil amonio cristal violeta, sales biliares cristal violeta, sales biliares cloruro de sodio desoxicolato de sodio Cloruro de litio y telurito de potasio cloruro de sodio Tetrationato, sales biliares (verde brillante)

Azcar fermentable lactosa ----lactosa lactosa manitol lactosa, xilosa, sacarosa ----------------

Sistema Indicador rojo fenol ----rojo neutro rojo neutro rojo fenol rojo fenol, citrato frrico amnico y tiosulfato de sodio yema de huevo, telurito de potasio ----------produccin de gas

verde brillante, sales lactosa biliares


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TEST DE ESTERILIDAD

INTRODUCCION El test de esterilidad se aplica a productos que deben ser estriles y se realiza para verificar que efectivamente estn libres de contaminacin microbiana. Deben ser estriles la gran mayora de los productos suministrados por va parenteral (inyectables, sueros), los materiales que estn en contacto con el medio interno (apsitos, suturas, fluidos para irrigaciones, material quirrgico) y los productos oftlmicos. A medida que los avances tecnolgicos permiten obtener productos de mejor calidad, esta exigencia se va extendiendo a otros materiales tales como los de aplicacin tica o sobre algn tipo de mucosas. El test de esterilidad se encuentra descrito en las Farmacopeas donde debe ser estudiado como complemento de este trabajo. Por esterilidad se entiende ausencia de cualquier forma de vida. El trmino esterilidad es absoluto. El proceso mediante el cual se logra este estado se denomina "esterilizacin" y se define como "el proceso de eliminar toda forma de vida". Este proceso est diseado para minimizar la probabilidad de que haya microorganismos sobrevivientes. Por lo tanto, siempre existe una probabilidad finita de que quede algn microorganismo vivo.

LIMITACIONES DEL TEST DE ESTERILIDAD 1) El test de esterilidad es un procedimiento destructivo, por lo tanto slo se puede aplicar a una parte del lote del material a analizar. Por esta razn no puede asegurarse la esterilidad de todo el lote. Empleando conceptos estadsticos se recurre a un plan de muestreo que establece para un nivel de confianza dado, que el porcentaje de contaminacin del lote est por debajo de cierto lmite. Por ejemplo: para un resultado negativo (ausencia de crecimiento) en 20 muestras de un lote dado, se asegura con un nivel de confianza del 95%, que el nivel de contaminacin del lote est por debajo del 5%. Para asegurar que ese lote tiene un nivel de contaminacin menor que el 1%, con un nivel de confianza del 99%, sera necesario analizar 500 muestras, lo que resultara impracticable. Como se observa, tal como est diseado el mtodo slo permite detectar una contaminacin grosera. 2) El ensayo no garantiza la deteccin de todos los microorganismos conocidos. Es imposible disear un mtodo que permita recuperar todos los posibles m.o. contaminantes. Los medios de cultivo empleados y las condiciones de incubacin limitan el nmero de m.o. a recuperar, a un cierto grupo. Quedan excluidos por ejemplo los m.o. exigentes, los anaerobios muy estrictos y los virus. A ello se agrega el hecho de que si el material fue sometido a un proceso de esterilizacin, los m.o. sobrevivientes se encuentran "estresados" y aunque no se recuperen en las condiciones de realizacin del test, podran proliferar en medios ms ricos como el medio interno. 3) Para darle confiabilidad a un resultado positivo del test (desarrollo de m.o.) habra que asegurarse de que la contaminacin no fue introducida durante la realizacin del ensayo (falso positivo). Aunque se han mejorado las condiciones de realizacin del mismo, todava siguen siendo un factor importante de fuente de error. Esto se contrapone a la idea de que se debe aumentar el nmero de muestras para aumentar la confiabilidad del test, porque tambin aumenta la posibilidad de tener falsos positivos.


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MTODOS DE ENSAYO a) Inoculacin directa Consiste en la transferencia directa del producto a ensayar desde su recipiente de origen al medio de cultivo apropiado. b) Filtracin por membrana Consiste en la filtracin del producto a ensayar si es lquido o una solucin del mismo a travs de una membrana de porosidad adecuada (no mayor de 0,45 m). Los microorganismos quedan retenidos en la membrana. sta se coloca aspticamente en los medios de cultivo y se incuba. Se aplica a formas lquidas y a productos que puedan solubilizarse en disolventes apropiados (esterilizables e inocuos para los microorganismos). Permite ensayar un volumen mayor de muestra. Es particularmente apropiado para productos con propiedades bacteriostticas o fungistticas. Es el mtodo de eleccin siempre que sea posible.

DISEO EXPERIMENTAL 1) Muestreo Las Farmacopeas establecen el nmero de unidades a ensayar y la toma de cada unidad segn el contenido y tipo de producto. Para la seleccin de las muestras es conveniente conocer el proceso de esterilizacin, de manera de ensayar las unidades que tienen mayor riesgo de no haber quedado esterilizadas; por ejemplo, en una esterilizacin por calor hmedo se ensayan las unidades que estn en los "puntos fros" del autoclave. Obviamente, el producto esterilizado debe estar contenido en un envase que conserve su esterilidad, por lo tanto si esto no se cumple carece de sentido realizar el test de esterilidad.

CANTIDAD MINIMA DE MUESTRA A USAR PARA CADA MEDIO USP 30 Cantidad por envaseLquidos (no antibiticos) Menos de 1 mL 1 40 mL Ms de 40 y no ms de 100 mL Ms de 100 mL Lquidos antibiticos Otras preparaciones solubles en agua o en miristato de isopropilo Slidos Menos de 50 mg 50 mg o ms pero menos de 300 mg 300 mg 5 g Ms de 5 g El contenido total de cada envase La mitad del contenido de cada envase pero no menos de 50 mg 150 mg 500 mg El contenido total de cada envase La mitad del contenido de cada envase pero no menos de 1 mL 20 mL 10% del contenido del envase pero no menos de 20 mL 1 mL El contenido total de cada envase para suministrar no menos de 200 mg

Cantidad mnima a tomar de cada unidad


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NUMERO MINIMO DE ARTICULOS A ENSAYAR EN RELACION CON EL NMERO DE ARTCULOS EN LA PARTIDA USP 30

Nmero de artculos en la partidaPreparaciones parenterales No mas de 100 envases Ms de 100 pero no ms de 500 Ms de 500 envases Parenterales de gran volumen Antibiticos slidos Menos de 5 g Mayor o igual a 5 g Preparaciones oftlmicas y otras no inyectables No ms de 200 envases Ms de 200

Nmero mnimo de artculos a ensayar para cada medio*

10% o 4 envases lo que resulte mayor 10 envases 2% o 20 envases lo que resulte menor 2% o 10 envases lo que resulte menor

20 envases 10 envases

5% o 2 envases lo que resulte mayor 10 envases

* Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios esta columna da el nmeo de envases necesarios para los dos medios juntos.

2) Medios de cultivo Los medios de cultivo fueron seleccionados para favorecer el desarrollo del ms amplio espectro de microorganismos posible. Los recomendados actualmente son: Caldo Tripticasa Soja (TSB o Tryptic Soy Broth) y Caldo tioglicolato. El TSB se propone para recuperar bacterias aerobias, hongos y levaduras, y se incuba a 22,5 2,5C. El Tioglicolato favorece el crecimiento de microorganismos anaerobios por ser un medio de bajo potencial redox, aunque permite tambin el desarrollo de microorganismos aerobios. Se incuba a 32,5 2,5C. El bajo potencial redox se logra con el agregado de reductores (cistena y cido tiogliclico) y un bajo porcentaje de agar que disminuye la difusin del oxgeno. El medio incluye resazurina como indicador del potencial redox. Se considera que el medio est apto para el uso cuando no ms del tercio superior del volumen total est oxidado (rosado). Los medios deben ser sometidos a dos tipos

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