Bioassay

Bioassays

Erna Sulistyowati

Types of Assays

• Chemical Assays: Spectrophotometry, Spectrofluorimetry, Chromatography,

• Immunoassays• Microbiological assays

Definition– Estimation of the concentration / potency of a

substance by measuring its biological response in living systems

– i.e.Observation of pharmacological effects on • [1] living tissues, or cells

• [2] microorganisms

• [3] animals

Indications for Bioassay• Active principle of drug is unknown• Active substance cannot be isolated, e.g. insulin,

posterior pituitary extract etc. • Chemical method is either

– not available – if available, too complex, – insensitive to low doses e.g. Histamine can be bioassayed in

microgram conc. • Unknown Chemical composition, e.g. long acting thyroid

stimulator. • Chemical composition of drug variable but has same

pharmacological action e.g. cardiac glycosides isolated from different sources, catecholamines etc.

Principles of Bioassay• Active principle to be assayed should show the same measured

response in all animal species• The degree of pharmacological response produced should be

reproducible under identical conditions [Eg Adrenaline shows same rise in BP in the same species under identical conditions: wt, age, sex, strain / breed etc]

• The reference standard must owe its activity to the principle for which the sample is being bioassayed

• Activity assayed should be the activity of interest• Individual variations must be minimised / accounted for• Bioassay might measure a diff aspect of the same substance

compared to chemical assay [Eg testosterone & metabolites

Types of Bioassays

• [1] Quantal Assays [ Direct endpoint ]– Elicits an ‘All or None’ response in different animals– Eg.

• Digitalis induced cardiac arrest in guinea pigs• hypoglycemic convulsions in mice. • Digitalis induced head drop in rabbits• Calculation of LD50 in mice or rats

• [2] Graded Response Assays [mostly on tissues]– Graded responses to varying doses– Unknown dose response measured on same tissue

Methods of Bioassay con1• [2] Graded Response Assays [ Direct comparison on same

tissues]– Interpolation: Conc. of unknown is read from a standard plot of a

log dose response curve of at least 4 sub maximal concentrations– Matching / Bracketing: Const dose bracketed with varying doses

of standard till exact match is obtained• Used when test sample is too small• Inaccurate & margin of error difficult to estimate• Eg histamine on guinea pig ileum, Posterior pituitary on rat uterus

– Multiple Point Assays• 3 point assay [combines pples of matching with interpolation]• 4 point assay [combines pples of matching with interpolation]

3 point assay [2+1 dose assay]• Fast & convenient• Procedure [Eg Ach bioassay]

– Log dose response [LDR] curve plotted with varying conc of std Ach solutions and given test solution

– Select two std doses s1& s2 [ in 1:2 dose ratio] from linear part of LDR [ Let the corresponding response be S1, S2]

– Choose a test dose t with a response T between S1 & S2 – Record 4 sets data [Latin square: Randomisation reduces error] as

follows• s1 s2 t• t s1 s2• s2 t s1• s1 s2 t

– Plot mean of S1, S2 and T against dose. Calculate – Log Potency ratio [ M ] = [ (T –S1) / (S2-S1) ] X log d

[d = dose ratio]

4 point assay [2 +2 dose assay]• Procedure [Eg Ach bioassay]

– Log dose response [LDR] curve plotted with varying conc of std Ach solutions and given test solution

– Select two std doses s1& s2 from linear part of LDR [ Let the corresponding response be S1, S2]

– Choose two test doses t1 & t2 with response T1 &T2 between S1 & S2 ; Also s2/s1 = t2/t1 = 2

– Record 4 data sets [Latin square: Randomisation reduces error]• s1 s2 t1 t2• s2 t1 t2 s1• t1 t2 s1 s2• t2 s1 s2 t1

– Plot mean of S1, S2 and T1, T2 against dose. Calculate – Log Potency ratio [M] = [ (T1 –S1 + T2 –S2) / (S2-S1 + T2-T1) ] X log

d [d = dose ratio]

Preparasi Bioassay (contoh pada aorta)• Setelah tikus dibunuh, selanjutnya thorax segera dibuka dicari aorta yang

dekat dengan jantung dan sejajar dengan esofagus (aorta descendens pada cavum thoracalis).

• Aorta diambil mulai dari arcus aorta sampai sepanjang mungkin ke arah distal, dipindahkan ke petri dish yang berisi larutan Kreb’s dingin yang sudah diaerasi dengan karbogen (95% O2 dan 5% CO2).

• Aorta dibersihkan dari jaringan ikat sekitarnya, kemudian dipotong spiral sehingga dihasilkan lembaran aorta seperti pita dengan lebar 3 mm dan panjang 1,2 cm.

• Kedua ujung aorta diikat dengan benang dan dimasukkan dalam organ bath volume 10 ml posisi vertikal. Salah satu ujung diikat pada fiksatif dan ujung yang lain dikaitkan dengan transducer isotonik ‘Ugo Basile’ dengan berat beban 2 g yang dihubungkan dengan rekorder (McLab).

Preparasi Bioassay (contoh pada aorta)

• Kontraksi aorta dicatat akibat tarikan mekanik pada transduser yang dikonversi ke energi listrik.

• Jaringan dibiarkan untuk ekuilibrasi dalam double jacketed organ bath yang terus diaerasi dengan karbogen selama 2-3 jam atau sampai kontraksi dinilai stabil.

• Selama ekuilibrasi larutan Kreb’s diganti (wash out) setiap 15 menit.

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi Aorta dengan Teknik Bioassay

• Efek quercetin terhadap kemampuan relaksasi pembuluh darah, dilakukan dengan menggunakan organ terpisah melalui metode pengukuran bioassay.

• Pengukuran kemampuan vasodilatasi pembuluh darah aorta menunjukkan bahwa pada kondisi obesitas, pemberian acethylcholine sedikit memberikan efek dilatasi.

• Namun pada kelompok obesitas 160 hari terlihat kemampuan dilatasi yang lebih kecil daripada kelompok obesitas 90 hari.

• Pada pemberian quercetin dosis 2 mg/kg BB, acethylcholine memberikan efek dilatasi yang lebih besar dari pada kondisi obesitas pada aorta.

• Pada pemberian dosis 10 mg/kg BB, acethylcholine memberikan efek dilatasi pada aorta yang lebih besar daripada pemberian quercetin dosis 2 mg/kg BB, demikian pula pada pemberian quercetin 50 mg/kg BB.

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi Aorta dengan Teknik Bioassay

• Hal ini menunjukkan adanya perbaikan fungsi sel endotel pada dosis 2, 10 mg/kg BB maupun 50 mg/kg BB, tetapi pemberian quercetin 10 mg/kg BB menunjukkan adanya perbaikan fungsi endotel yang lebih besar daripada kedua dosis quercetin lainnya. Efek dilatasi yang terjadi sebagai respon terhadap acethylcholine pada setiap perlakuan dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 5.2 Besar vasodilatasi pada aorta terpisah terhadap Ach 10-4 M dari tikus (µV), yang sebelumnya diprekontraksi dengan PE 10-4M.

Kelompok Mean ± SD *

Kontrol 56.317 ± 11.234 d

Kontrol Obes 90 hari 6.059 ± 2.458 ab

Kontrol Obes 160 hari 3.040 ± 0.900 a

Obese+Quercetin 2 mg/kg BB 18.043 ± 17.459 ab

Obese+Quercetin 10 mg/kg BB 49.952 ± 10.463 cd

Obese+Quercetin 50 mg/kg BB 30.009 ±16.489 bc

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (p<0,05)

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi Aorta dengan Teknik Bioassay

• Angka diatas menunjukkan efek dilatasi pada pembuluh darah aorta yang sebelumnya diprekontraksi dengan phenylephrine 10-4 M. Kemampuan dilatasi ini merupakan respon pembuluh darah terhadap acetylcholine. Kontraksi dan dilatasi ini diukur dengan Power Lab.

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi Aorta dengan Teknik Bioassay

Diagram rerata besar vasodilatasi pada aorta terpisah terhadap Ach 10-4 M dari tikus (µV), yang sebelumnya diprekontraksi dengan PE 10-4M berdasarkan kelompok perlakuan.

Kelompok 1: Kontrol, Kelompok 2: Kontrol Obes 90 hari, Kelompok 3: Kontrol Obes 160 hari, Kelompok 4: Obese+Quercetin 2 mg/kg BB, Kelompok 5: Obese+Quercetin 10 mg/kg BB, Kelompok 6: Obese+Quercetin 50 mg/kg BB

Gambar Hasil pengukuran kemampuan relaksasi dengan organ terpisah. Keterangan : tanda panah menunjukkan posisi respon relaksasi pada grafik hasil pembacaan dengan menggunakan PowerLab.Kelompok 1: Kontrol, Kelompok 2: Kontrol Obes 90 hari, Kelompok 3: Kontrol Obes 160 hari, Kelompok 4: Obese+Quercetin 2 mg/kg BB,

Kelompok 5: Obese+Quercetin 10 mg/kg BB, Kelompok 6: Obese+Quercetin 50 mg/kg BB

1

54

32

6