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MINISTERIO DE AGRICULTURA Instituto de Investigaciones Agropecuarias Centro Regional Intihuasi MICROPROPAGACIÓN DE ALCACHOFAS SIN ESPINAS (Cynara scolymus L.) ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL INIA, DONOSO – HUARAL LIMA PERÚ Autores: Claudia Vásquez Romero Técnico Agrícola Víctor Alfaro Espinoza Ing. Ejec. Agrícola La Serena, septiembre 7 del 2009.
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Alcachofa Sin Espinas

Jul 25, 2015

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Page 1: Alcachofa Sin Espinas

MINISTERIO DE AGRICULTURA Instituto de Investigaciones Agropecuarias

Centro Regional Intihuasi

MICROPROPAGACIÓN DE ALCACHOFAS SIN ESPINAS

(Cynara scolymus L.)

ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL INIA, DONOSO – HUARAL

LIMA PERÚ Autores: Claudia Vásquez Romero Técnico Agrícola Víctor Alfaro Espinoza Ing. Ejec. Agrícola

La Serena, septiembre 7 del 2009.

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INDICE

INTRODUCCIÓN…………………....................................................................1 OBJETIVOS…………………………………………………………………………1 MICROPROPAGACIÓN EN ALCACHOFAS………………………………….2 ETAPAS EN LA PROPAGACIÓN DE PLANTAS DE ALCACHOFA………..3 DESINFECCIÓN DE EXPLANTES……………………………………………….5 MEDI O DE CULTIVO………………………………………………………………5 FASE DE INICIO…………………………………………………………………….7 FASE DE MULTIPLICACIÓN…………………………………………………….10 FASE DE ENRAIZAMIENTO Y ACLIMATACIÓN…………..…………………11 OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS………………………………………….13 CONTACTOS REALIZADOS……………………………………………………..14

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INTRODUCCIÓN El proyecto “Aumento del potencial productivo y comercial de la agroindustria de

alcachofa mediante mejoramiento genético y optimización de factores claves en la

cadena de producción”, financiado por INNOVA CORFO, que está siendo ejecutado

por INIA, CRI Intihuasi, tiene como objetivo principal la selección y multiplicación

masiva de uno o más clones mejorados de alcachofa tipo Argentina de alto

rendimiento agroindustrial. Estos materiales seleccionados de diferentes sectores de la

región de Coquimbo, por su productividad y uniformidad, deben ser masificados a un

número tal, que permitan hacer pruebas de su comportamiento en terreno, para una

superficie media hectárea, lo que significa un número de plantas superior a 5.000.

La técnica de micropropagación permite contar con ese número de plantas de

similares características, lo que sería imposible a través del método de propagación

tradicional, otra gran ventaja que presenta este método de multiplicación es que el

material propagado se encuentra libre de patógenos.

Para realizar esta labor, el proyecto contempla la capacitación en esta técnica, a los

Investigadores y Ayudantes de Investigación que participan en la ejecución del

proyecto.

Entre los días 10 y 21 de agosto del año en curso se realizó el curso taller de

Micropropagación de Alcachofas sin Espinas (Cynara scolymus L.) en el Laboratorio

de Biotecnología de la Estación Experimental Agraria Donoso-Huaral del Instituto

Nacional de Innovación Agraria de Perú por el Programa Nacional de Investigación en

Hortalizas.

OBJETIVOS

1. Producción de Material vegetal de alcachofa con adecuadas garantías en

aspecto de identidad genética y condiciones fitosanitarias

2. Generar las condiciones para posible incorporación de paquetes tecnológicos

en el manejo de material propagado in vitro.

3. Generar las condiciones para que el INIA o las empresas agroindustriales

puedan abastecer con plantas sanas a los agricultores que entreguen su

producción a la industria procesadora de alcachofines o fondo de alcachofa.

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MICROPROPAGACIÓN EN ALCACHOFA

La alcachofa en la mayoría de los países donde se cultiva, se propaga casi

exclusivamente en forma vegetativa. El material de propagación se obtiene

directamente de plantas adultas en el mismo campo, con lo que se corre el riesgo de

propagación de plantas deficientes sanitariamente. Esto ha despertado el interés de

los investigadores en desarrollar técnicas de propagación in vitro para esta especie.

Sin embargo, para el caso de alcachofas precoces, como es el caso de Blanca de

Tudela y, por añadidura de la alcachofa tipo “Argentina”, la micropropagación no se ha

desarrollado como herramienta por una pérdida de precocidad de los materiales

propagados y por una tasa muy baja de multiplicación. A pesar de ello, la propagación

in vitro, se convierte en la única alternativa para propagar masiva y rápidamente

clones elite de alcachofa dentro de un programa de mejoramiento.

Alta concentración de hormonas en los medios de cultivo, y el uso de antioxidantes

han permitido el desarrollo de protocolos de propagación in vitro de alcachofa.

ETAPAS EN LA PROPAGACIÓN DE PLANTAS DE ALCACHOFA

1.- Selección y acondicionamiento de explantes El material vegetal a utilizar provendrá de plantas madres con hijuelos idealmente

juveniles (4 semanas) y entre 25 a 30 centímetros de longitud promedio, los cuales

deben ser colectados el mismo día que se van a preparar, ya que se ha visto

disminuciones en el porcentaje de prendimiento cuando se colectan el día anterior a la

siembra. El procedimiento resumido es el siguiente:

A.- Colecta de hijuelos desde terreno: estos son seleccionados en el campo,

descartando todo el material vegetal que presente daño visible causado por hongos,

bacterias o daño mecánico, ya que un hijuelo enfermo va a producir una gran cantidad

de explantes contaminados.

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Selección de plantas con buena cantidad y

tamaño de hijuelos.

Planta con daño causado por agentes

patógenos, no apta para propagación.

B.- Preparación del hijuelo en el campo: Los hijuelos seleccionados son preparados al

igual que para plantación, se eliminan las hojas exteriores, tierra o barro que puedan

contener en sus raíces o tallos, y el follaje es cortado a un largo aproximado de 30 cm

de longitud.

Hijuelos deshojados y cortados a 30 cm

aproximadamente.

Extracción de tierra y barro en el campo

C.- Lavado del material vegetativo: los hijuelos son llevados a laboratorio, donde son

lavados con agua potable y chorro continuo, para eliminar toda impureza orgánica o

mineral que puedan traer desde el campo.

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Lavado de hijuelos en laboratorio. Lavado de hijuelos en laboratorio.

D.- Preparación de explantes: Una vez listo el material colectado, se comienza a

deshojar hasta llegar a un tamaño de 2 a 5 cm de longitud, la base de las yemas es

cortada con cuchillo dándole una forma cuadrangular con la finalidad de facilitar la

manipulación.

Explantes deshojados. Preparación de las bases de las yemas.

Yema preparada para trabajar en cámara. Yema e instrumental necesario.

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2.- Desinfección de explantes

Todo el proceso de desinfección y manejo de las yemas se realiza con las mejores

condiciones de asepsia y materiales completamente esterilizados, para evitar

contaminación del medio de cultivo y/o muerte del meristema:

Una vez realizado el triple enjuague con agua destilada, son llevadas a la

cámara de flujo laminar para su preparación.,

Luego en la cámara de flujo las yemas se sumergen en alcohol al 70%

por 1 minuto, agitando constantemente ya que este elimina las burbujas de

aire y permite una mejor penetración del desinfectante.

La desinfección se realiza con hipoclorito de sodio al 2% por 12 minutos

agitando de vez en cuando, posteriormente se enjuaga tres veces con

agua destilada esterilizada.

Para evitar la fenolización de los tejidos, se prepara una solución de ácido

ascórbico (100 mg. en 250 cc. de agua destilada) el que es esterilizado con

filtro de 0,22 µm de porosidad, luego las yemas son introducidas en la

solución antioxidante y se mantienen en ella hasta el momento de la

disección del meristema.

Traslado de yemas a la

cámara de flujo laminar.

Desinfección de yemas con

hipoclorito de sodio.

Filtro para esterilizar

solución antioxidante.

3.- Medio de cultivo Se utiliza el medio MS (Murashige y Skoog), el cual además de las sales orgánicas e

inorgánicas que se utilizan en la preparación, lleva azúcar blanca refinada al 3% o

sacarosa, ajustando el pH a 5.7, utilizando HCl 1.0 N o NaOH 1.0 N dependiendo si se

requiere bajar o subir, la solución resultante se calienta a fuego lento para disolver el

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agar – agar, que se agrega como solidificante. Finalmente se agregan los reguladores

de crecimiento, los cuales van a depender del medio de cultivo a preparar (fase inicio,

multiplicación, enraizante, etc.), posteriormente y antes que el medio se enfríe, es

dispensado a tubos o contenedores donde se realizaran las siembras o propagación.

Todos los materiales utilizados y que ingresen a la sala de siembra incluido el medio,

deben ser esterilizados en autoclave a 121° C y 1,2 k cm-2

de presión por 20 minutos.

Preparación del medio de cultivo.

Aplicar nutrientes al medio de cultivo. Preparación del medio de cultivo a fuego

lento.

Distribución del medio de cultivo en tubos

de ensayos para siembra.

Esterilización del medio de cultivo en

autoclave.

Preparación de los materiales a esterilizar en autoclave y que serán usados en cámara

de flujo laminar para siembra de meristemas.

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Empaque con papel y polipropileno de

placas petri.

Vasos precipitados.

Empaque de bisturís y pinzas. Materiales listas para ingresar a

esterilización.

4.- Fase de inicio

Como explante se usan yemas con 3 a 4 primordios foliares. La disección se realiza

bajo lupa estereoscópica en cámara de flujo laminar. La eliminación de los primordios

externos y los cortes inducen a la acumulación de fenoles en el explante que impiden

el desarrollo y reducen drásticamente el porcentaje de prendimiento, por lo que el

corte debe ser muy rápido. Inmediatamente debe sembrase en el medio de inicio que

corresponde a medio MS suplementado con ANA (Ácido Naftaleno Acético, 0,5 ppm) y

BAP (Bencil Amino Purin, 0,2 ppm). Los tubos sembrados deben ir inmediatamente a

oscuridad por 4 días y posteriormente aclimatar los explantes a la luz hasta llegar a los

3.000 lux. Cada 7 a 10 días se debe ir subcultivando con el mismo medio de cultivo

para evitar la oxidación. Esta fase dura aproximadamente 10 semanas y las

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condiciones de trabajo corresponden a temperaturas de 23° C y fotoperiodos de 16

horas luz.

Importante es tener los materiales e implementos a utilizar en cámara de flujo laminar

listos y a la mano, ya que una vez instalados el proceso de limpiesa de tejido y

siembra debe ser lo más rapido posible para evitar fenolización.

Preparación de material a usar en

cámara.

Preparación de material a usar en

cámara.

Preparación de tejidos meristematico en cámara de flujo laminar, el trabajo en esta

etapa debe ser rápido y cuidadoso y con optimas condiciones de asepsia.

Eliminación de primordios externos

Eliminación de primordios cercanos al

meristema.

Tamaño de meristema óptimo para siembra, con un par de primordios foliares.

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Meristema protegido por un par de

primordios.

Yema de buen tamaño para siembra.

Yema extraida antes de la siembra

Yema fenolizada, no apto para sembrar. Yema en condiciones para siembra.

Siembra en medio inicio

Tipo de tubo utilizado para siembra de

yema en medio de inicio.

Siembra de yema en tubo con medio de

cultivo.

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Inmediatamente sembrados los tubos tienen que ser pustos en oscuridad para evitar

que continue la fenolización del tejido meristematico, bajo la cámara de flujo se van

ubicando en un vaso presipitado oscurecido con papel roneo y tapa de palel aluminio,

posteriormete se dejan en cámara oscura por 4 días.

Baso precipitado, protegido internamente

con papel para oscurecer.

Caja de cartón negro para mantener en

oscuridad los tubos sembrados.

Microplantas después de 10 semanas en

medio de iniciación. Microplantas después de 10 semanas en

medio de iniciación.

5.- Fase de multiplicación Cuando las microplantas alcanzan el tamaño de 2 cm, se transfieren a un medio MS

suplementado con BAP (1 ppm). Luego de 6 semanas en promedio se obtienen de 3

a 8 brotes por microplanta, los pequeños se pueden sembrar en los mismos tubos con

medio de inicio para que se desarrollen. Los brotes más grandes se pasan

nuevamente a multiplicación en contenedores más grande, los ciclos de propagación

es conveniente que no superen los 8 o 9 ya que las plantas van perdiendo vigor.

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Las microplantas se extraen del medio, se limpian y se llevan a medios de

multiplicación.

Microplantas en medio de propagación,

listas para multiplicación.

División de brotes en la multiplicación.

Microplantas de mayor tamaño, pasan a

medio de multiplicación.

Microplantas más pequeñas, pasan a

medio de inicio, para continuar desarrollo.

6.- Fase de enraizamiento y aclimatación

Se debe promover la diferenciación de los tejidos para inducir la formación de raíces,

ya que algunas especies por sus características fisiológicas no pueden enraizar

directamente “in Vitro”, para ello se usa medio MS suplementado con ANA (1 ppm).

Luego de 4 semanas cuando se observa la formación de sistema radical, las plantas

se traspasan a un medio MS suplementado con IBA (1 ppm), para proliferación de

raices. Cuando las plantas alcanzan 2 cm de raíz pueden adaptarse a condiciones

ambientales externas, en un invernadero con temperatura controlada de 23° C. La

aclimatación ocurre aproximadamente en 6 semanas.

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Tamaño de planta optimo para llevar a

enraizamiento.

Siembra en medio de enraizamiento.

Una vez terminada la etapa de enraizamiento, las plantas son extraídas de sus

contenedores, se retiran los restos de agar con ayuda de pinzas y se lavan las raíces

en agua destilada, sujetando las plántulas delicadamente para no quebrarlas ya que

esta no son muy flexibles.

El sustrato utilizado puede ser arena de río lavada y esterilizada ó también se puede

usar sustrato comercial a base de musgo, que ya viene desinfectado, este proceso de

aclimatación toma alrededor de 5 semanas, por lo tanto el tiempo mínimo para obtener

plántulas a partir de microplantas in vitro es de 6 meses hasta 8 a 10 meses.

Invernadero utilizado para aclimatación de

plantas.

Invernadero utilizado para aclimatación

de plantas.