estauja.ujaen.es/bitstream/10953.1/8701/1/TFG_Juzdado... · 2018-12-04 · 3 3. INTRODUCCIÓN 3.1. Definición del kéfir El kéfir es una bebida fermentada, carbonatada y ácida

Fa

cultad d

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s E

xperim

enta

les

Gra

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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales

Trabajo Fin de Grado

Estudio de la comunidad microbiana del kéfir

tradicional y aislamiento de microorganismos con

actividad microbiana




Alumno: Rocío Juzdado Martos

Julio, 2018


UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales

Trabajo Fin de Grado





Julio, 2018

ÍNDICE

1. RESUMEN………………………………………………………………………………. 1

2. ABSTRACT……………………………………………………………………………… 1

3. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….. 3

3.1. Definición del kéfir…………………………………………………………………. 3

3.2. Historia del kéfir……………………………………………………………………..3

3.3. Producción del kéfir…………………………………………………………………4

3.4. Tipos de kéfir………………………………………………………………………...5

3.5. Aspectos microbiológicos…………………………………………………………..7

3.5.1. Bacterias del Kéfir……………………………………………………………8

3.5.2. Levaduras del Kéfir…………………………………………………………..9

3.5.3. Matriz…………………………………………………………………………..9

3.6. Efectos beneficiosos………………………………………………………………..9

3.6.1. Actividad antimicrobiana…………………………………………………….9

3.6.2. Actividad antitumoral………………………………………………………..10

3.6.3. Otros efectos………………………………………………………………...10

4. OBJETIVOS……………………………………………………………………………..12

5. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………...13

5.1. Muestras del kéfir………………………………………………………………….13

5.2. Medios de cultivo…………………………………………………………………..13

5.3. Material de laboratorio…………………………………………………………….17

5.4. Bacterias indicadoras utilizadas………………………………………………….18

5.5. Determinación de la microbiota del kéfir………………………………………...18

5.6. Identificación preliminar de microorganismos de interés……………………....20

5.7. Detección actividad antimicrobiana……………………………………………...21

5.7.1. En medio sólido……………………………………………………………..21

5.7.2. En medio líquido…………………………………………………………….22

6. RESULTADOS………………………………………………………………………….23

6.1. Recuento de la comunidad microbiana del kéfir……………………………......23

6.2. Selección de los microorganismos de interés e identificación preliminar…....27

6.3. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio sólido……………….28

6.4. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio líquido……………...29

7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………..31

8. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………………32

9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………...34

1

1. RESUMEN

En los últimos años, los alimentos beneficiosos con microorganismos probióticos

han ganado un gran interés para su consumo. Un claro ejemplo es el kéfir del cual

existen numerosos estudios que abalan su actividad antimicrobiana,

inmunoestimulante, antitumoral entre otros efectos beneficiosos. En este trabajo,

se plantea la investigación de la comunidad microbiana del kéfir de leche con la

finalidad de encontrar microorganismos que presenten actividad antimicrobiana

frente a bacterias indicadoras tales como Listeria innocua, Enterococcus faecalis

S-47 y Staphylococcus aureus, patógenos causantes de enfermedades en

humanos. Mediante el método de cruces en medio sólido y la técnica de ensayo

con pocillos en medio líquido con la fracción no microbiana del kéfir. Se concluyó

que el mejor efecto antimicrobiano observado fue contra S. aureus y L. innocua en

medio sólido con halos de inhibición de entre 5 y 10mm. Mientras que en medio

líquido la única actividad antimicrobiana observada fue contra S. aureus. Los

resultados obtenidos apoyan la actividad antimicrobiana que presenta la bebida

del kéfir probablemente debido a la compleja asociación de cepas próbioticas que

producen sustancias antibacterianas.

Palabras clave: Probóticos, actividad antimicrobiana, bacterias indicadoras,

sustancias antibacterianas.

2. ABSTRACT

In recent years, beneficial products with probiotic microorganisms have gained

great interest for their consumption. A clear example is that it contains so many

studies that its antimicrobial activity, immunostimulant, antitumor among other

beneficial effects. In this work, the investigation of the microbial community of milk

cancer was proposed in order to find microorganisms that show antimicrobial

activity against indicator bacteria such as Listeria inocua, Enterococcus faecalis S-

47 and Staphylococcus aureus, pathogens that cause diseases in humans. By

means of the method of crosses in solid medium and the test technique with wells

in liquid medium with the non-microbial fraction of kefir. It was concluded that the

best antimicrobial effect was against S. aureus and L. innocua on solid medium

with inhibition halos between 5 and 10 mm. While in liquid medium the only

antimicrobial activity observed was against S. aureus. The results obtained support

2

the antimicrobial activity of the kefir drink, probably due to the new association of

probiotic strains that produce antibacterial substances.

Key words: Probotic, antimicrobial activity, indicator bacteria, antibacterial

substances.

3

3. INTRODUCCIÓN

3.1. Definición del kéfir

El kéfir es una bebida fermentada, carbonatada y ácida cuyo sabor se debe al ácido

láctico. Se trata de una combinación de bacterias probióticas y levaduras en una matriz

de proteínas, lípidos y azúcares (González Alonso, 2011). Los granos de kéfir actúan

como iniciadores naturales durante la producción de kéfir (Ilustración 1), tras la

fermentación son recuperados (Machado et al, 2013). Dichos granos pueden dividirse

y dar lugar a una nueva generación de granos con las mismas características que los

antiguos. (Prado et al, 2015)

Desde hace mucho tiempo, se ha asociado el consumo de productos lácteos

fermentados con la capacidad de otorgar

beneficios a la salud (Bourrie, 2016).

Debido al importante número de

microorganismos que encontramos en el

kéfir, las interacciones microbianas que

establecen y los compuestos bioactivos

producidos a partir de su metabolismo

confieren al kefir el papel de un próbiotico

natural, conocido como el yogur del siglo

XXI (Machado et al, 2013).

Según la Organización Mundial de la Salud

(OMS) los probióticos son microorganismos vivos que cuando se administran en

cantidades adecuadas confieren un beneficio al hospedador.

3.2. Historia del kéfir

La palabra kéfir procede de la palabra turca keyif, que se traduce por “sentirse bien”.

Dicha bebida recibió este nombre debido a la agradable sensación percibida después

de su consumo (Lemos et al., 2013). Su origen se sitúa en los Balcanes, Europa del

Este y el Cáucaso (Rodriguez et al., 2017). La ingesta de kéfir ha estado asociada con

la longevidad de los habitantes del Cáucaso (Kuwabara et al,1995; Rodriguez et

al,2017).

Ilustración 1. Gránulos de kéfir de

leche

4

Tradicionalmente, la leche de vaca, oveja, cabra o búfalo ha servido para la obtención

de kéfir. Aunque la escasez, el coste de dichas leches o costumbres religiosas han

llevado al intento de la producción de kéfir a partir de otros alimentos como la leche

de soja (Prado et al., 2015).

No se conocen con total exactitud los mecanismos a partir de los cuales se originaron

los gránulos de kéfir. Se cree que el origen de estos fue debido a las prácticas

realizadas por las tribus del Caucaso. A partir de leche cruda y el cuajar de ternero o

carnero en un cuenco de madera, se deja cuajar la leche. Una vez ha cuajado, la

fermentación se activa moviendo levemente la masa. A continuación, se cubre dicho

cuenco con la piel de carnero dejándose reposar durante uno o dos días. Tras estos

días, se separa la leche cuajada y se añade leche fresca, la cual vuelve a cuajar. Este

proceso requiere de unas cuantas repeticiones, tras las cuales en el interior del cuenco

se crea un poso espeso formado de multitud de gránulos. Dichos gránulos se dejan

secar y con un raspador son recogidos. De esta forma se obtienen los nódulos de kéfir

los cuales producirán una nueva fermentación cada vez que se les añada leche. Este

proceso ha quedado distanciado del usado actualmente, del que ya se parte de cepas

ya formadas las cuales son reproducidas de forma similar al del yogurt (Gálvez, 2012).

3.3. Producción del kéfir

Existen varios métodos para la producción de Kéfir. Tanto el procesado artesanal

como el procesado industrial son los más comúnmente usados. Aunque actualmente

se está intentando encontrar técnicas más modernas para la producción de este.

Procesado tradicional

Se produce añadiendo directamente los granos dde kéfir. La leche cruda es hervida y

enfriada a 20-25ºC e inoculada posteriormente con un 2-10% del grano de Kéfir. Tras

un período de fermentación, entre 18-24 horas a 25º C, los granos son separados de

la leche mediante filtración con un támiz los cuales se pueden secar a temperatura

ambiente para la siguiente inoculación. El kéfir se almacena a 4ºC durante un breve

tiempo y está listo para el consumo (Otles & Cagindi, 2003).

Procesado industrial

Se pueden usar diferentes métodos pero básicamente se sigue el mismo principio. El

primer paso a llevar a cabo es la homogenización de la leche al 8% de materia seca

5

y mantenerla en tratamiento térmico a 90-95ºC durante uno 5-10 minutos. Tras esto

se enfría a 18-24 ºC y se inocula con un 2-8% de cultivos de kéfir (Bacterias

iniciadoras) en tanques. El tiempo de fermentación es de 18-24 horas tras el cual, el

coagulo es separado mediante bombas y distribuido en botellas. Por último se deja

madurar a una temperatura entre 12-14 ºC y es almacenado listo para consumir. (Otles

&Cagindi, 2003).

3.4. Tipos de Kéfir

Existen tres tipos de Kéfir, de leche, de agua y de té o Kombucha. El kéfir de agua procede

de agua azucarada fermentada, mientras que el de leche está compuesto por leche

fermentada. Ambos poseen la misma microbiota adaptándola a sus respectivos medios (Ruiz,

2017).

3.4.1. Kéfir de leche

Se obtiene un producto similar al yogurt, resultado de una doble

fermentación (Ilustración 2). Por un lado, la de los gránulos del hongo y de

sus bacterias y por otro lado la de la propia leche. (Ruiz, 2017)

Mantenimiento de los nódulos de Kéfir

La leche debe ser cambiada cada dos días aproximadamente de tal modo

que el kéfir este renovándose continuamente. Es recomendable dejarlo en

reposo cada 15 o 30 días, en un recipiente con agua sin cloro durante 24

horas. El agua resultante de lavar el kéfir, puede ser aprovechada ya que

contiene kefiran (hexopolisacárido soluble). Elevadas temperaturas de

agua o el cloro pueden afectar negativamente sobre el cultivo de kéfir.

Conservación de los nódulos de Kéfir

Si se quiere interrumpir el cultivo de kéfir, podremos conservar los granos

durante el tiempo que se desee. Dependiendo del tiempo podremos

conservarlo junto con la leche fermentada en la nevera durante unos 3 o 4

días. Si se trata de un período más largo, de 8 a 10 días se les añadirá

agua mineral y una cucharada de azúcar, de igual forma se guardará en

la nevera. En cambio, cuando este periodo supera el año, se introducirán

en el congelador.

Para la reactivación, la descongelación de los gránulos se lleva a cabo a

temperatura ambiente introducidos estos en un recipiente con agua. Tras

esto, se puede realizar el proceso con normalidad.

6

Ilustración 2. Aspecto del kefir de leche

3.4.2. Kéfir de agua

Es preparado a partir de una solución de sacarosa entre 3 y 10%, frutas

frescas; limones, frutas secas; higos y un inóculo de los granos de kéfir.

Se dejan fermentando durante uno o días aproximadamente,

obteniéndose una bebida carbonatada, con un sabor ligeramente ácido

debido a la producción de ácido láctico y ácido acético, leve concentración

de azúcar y una sutil cantidad de alcohol (Monar et al., 2014).

Actualmente se desconoce el verdadero origen de los gránulos de kéfir de

agua. Se han encontrado evidencias de que podrían tener origen en el

cactus (Opuntia) mexicano en donde los gránulos eran removidos de las

hojas. Lactobacillus hilgardii ha sido propuesta como la principal bacteria

encargada de la producción del polisacárido, el cual forma parte de la

estructura del kéfir (Monar et al., 2014).

3.4.3. Kéfir de té o “Kombucha”

Este tipo de kéfir fermenta a partir de una infusión de té azucarada. Es un

proceso más lento que en el caso de los dos anteriores, tiene lugar en

torno a unos 15-30 días (Ilustración 3). Es recomendable que el recipiente

se encuentre abierto, ya que este tipo de kéfir fermenta mejor en

condiciones de aerobiosis. En cuanto al sabor puede variar desde un sabor

suave a un fuerte sabor avinagrado, ello depende del tiempo de

7

fermentación y el té usado. Se puede mezclar con zumo o frutas para que

su consumo sea más agradable.

La principal función de este tipo de kéfir es digestiva gracias a los ácidos

y enzimas que posee ayudando al proceso digestivo. (ProkeyDrinks, 2016)

Ilustración 3. Gránulos del kéfir de té o tíbico junto con el aspecto del kéfir de

té o Kombucha.

3.5. Aspectos microbiológicos

La producción del kéfir está basada en la actividad fermentativa de la microbiota de

los granos de kéfir sobre los componentes químicos de la leche. Los granos de kéfir

están compuestos por una asociación de microorganismos, embebidos en una matriz

de exopolisacáridos, proteínas y lípidos formando pequeños gránulos irregulares,

semiduros y de color blanco-amarillento (Satir y Guzel-Seydim, 2016; Rodriguez,

2017)

En la composición de los granos de kéfir ha sido evidenciado el predominio de

bacterias ácido lácticas, bacterias acéticas, levaduras y hongos. La microbiota

presente depende del origen del kéfir, el sustrato que se ha usado para su

fermentación y la manera en la que se ha mantenido el cultivo (Prado et al, 2015).

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son las principales responsables de convertir en

ácido láctico la lactosa presente en la leche, obteniendo como resultado una

disminución del pH y la conservación de la leche. Otros componentes microbianos del

kéfir incluyen levaduras fermentadoras de lactosa que producen etanol y CO₂

(Machado et al, 2013).

La tabla 1 muestra la composición de la microbiota presente en la bebida y/o en los

granos de kéfir.

8

Tabla 1. Microbiota del Kéfir (Rodriguez et al.,2017)

3.5.1. Bacterias del kéfir

Se pueden clasificar en dos grupos, bacteria lácticas homofermentativas y

heterofermentativas. Encontramos un 80% de Lactobacillus Kefiri en la bebida

fermentada final y un 20% de Lactobacillus paracasei ssp. Paracasei, Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus, Lactobacillus plantarum y

Lactobacillus kefiranofaciens. Además del género Lactococcus, Acetobacter y

Leuconostoc (Prado et al, 2015).

3.5.2. Levaduras del kéfir

Bifidobacterias Bacterias ácido acéticas

Bifidobacterium spp. Lb. acetobacter lavaniensis

Bifidobacterium bifidum Lb. Acetobacter syzygii

Bifidobacterium choerinum Lb. Acetobacter orientalis

Bifidobacterium choerinum Lb. Gluconobacter japonicus

Bifidobacterium longun Lb. Gluconobacter frateurii

Bifidobacterium pseudolongun

Bacterias ácido lácticas

Lactococcus (Lc.) lactis Lb. Satsumensis

Lc. Lactis subsp. lactis Lb. Brevis

Lc. Lactis subsp. cremoris Lb. plantarum

Lc. Raffinolactis Lb. Delbrueckii

Streptococcus thermophilus Lb. Acidophilus

Lactobacillus (Lb.) kefiranofaciens Lb. Delbrueckii subsp. bulgaricus

Lb. Kefiranofaciens subsp. kefirgranum Lb. Casei subsp. pseudoplantarum

Lb. Kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens Lb. Buchneri

Lb. Kefiri Lb. Sunkii

Lb. Parakefiri Lb. Otakiensis

Lb. Plantarum Lb. Diolivorans

Lb. Kéfir Lb. Crispatus

Lb. Paracasei Lb. Reuteri

Lb. Helveticus Lb. Leuconostoc mesenteroides

Lb. Parakefir Lb. Leuconostoc pseudomesenteroides

Levaduras

Lb. Saccharomyces (S.) cerevisiae Lb. Klu. Siamensis

Lb. S. martinae Lb. Klu. Lactis

Lb. S. unisporus Lb. Klu. Dobzhanskii

Lb. Candida humilis Lb. Kazachatania (Kaz.) unispora

Lb. Candida inconspicua Lb. Kaz. Exigua

Lb. Candida maris Lb. Torulospora delbrueckii

Lb. Candida kefir Lb. Brettanomyces anomalus

Lb. Candida colliculosa

Lb. Kluyveromyces (Klu.) marxianus

9

Han sido aisladas más de 23 especies de levadura diferentes. Aunque las

predominantes osn Saccharomyces cerevisiae, S. unisporus, Candida kefyr y

Kluyveromyces marxianus ssp. Marxianus (Prado et al., 2015)

3.5.3. Matriz

Kefirano, es un hexopolisacárido, compuesto por dos monosacáridos; glucosa y

galactosa el cual es separado de los granos de kéfir mediante la acción de

Lactobacillus kefiranofaciens. Por lo tanto, es esta bacteria la que da origen a esta

sustancia gelatinosa con múltiples efectos beneficiosos conocidos (Martin, 2017).

3.6. Efectos beneficiosos

3.6.1. Actividad antimicrobiana

La actividad antagonista de las BAL se debe a la producción de metabolitos con acción

antimicrobiana tales como; ácido láctico, ácido acético, peróxido de hidógeno, diacetilo

y bacteriocinas (Ramírez, 2010). Las bacteriocinas son un pequeño grupo de péptidos

antimicrobianos producidos por numerosas bacterias que inhiben el crecimiento de

otras bacterias. Se ha demostrado la presencia de cepas bacterianas productoras de

bacteriocinas en los granos de kéfir. (Miao et al, 2014)

A través de ensayos in vitro con extractos libres de células de kéfir, se ha demostrado

la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas tales como, Staphylococcus

aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Clostridium perfringens y Listeria

monocytogenes (Van Wyk, 2001)

Bolla et al (2013) reportaron evidencias del efecto protector de una mezcla constituida

por cepas bacterianas y levaduras aisladas del kéfir de leche contra una infección por

Clostridium difficile en un modelo de hámster. Dichos hámsteres bebieron ad libitum

una mezcla de extractos de microorganismos previamente aislados de los granos de

kéfir. Los resultados mostraron que solo aquellos hámsteres que ingirieron el extracto

de los microorganismos permanecieron vivos.

Lactobacillus kefiranofaciens actúa contra los principales patógenos causantes de

caries dental, Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus. Inhibe directamente el

crecimiento de estos dos patógenos (Jeong et al, 2018)

3.6.2. Actividad antitumoral

10

Ha sido evidenciada la actividad antitumoral presente en el kéfir contra múltiples tipos

de células cancerosas (Rodriguez et al, 2017). Ensayos in vivo como el llevado a cabo

por de Moreno de Le Blanc (2013) refuerzan este hecho. Mediante la ingesta de kéfir

ad libitum se produjo una disminución en el crecimiento de tumores en el modelo

murino de cáncer de mama. Además fue observado un incremento de la IL-10 en

suero y un decremento de células IL-6 (+) en las glándulas mamarias. Estos hechos

manifiestan la capacidad modulatoria del kefir sobre la respuesta inmune en las

glándulas mamarias y tumores.

Se ha demostrado la actividad inmuno-moduladora de las BAL aisladas de los granos

de kéfir las cuales aumentan la apoptosis de células de leucemia mieloide humana

resistentes a múltiples fármacos in vitro a través de la activación de la caspasa 3 de

una manera dependiente a la dosis. (Hong et al, 2009)

Ha sido evidenciado como el sobrenadante de kefir, induce la producción de citocinas

pro-inflamatorias en células RAW 264.7, tales como el factor de necrosis tumoral

(TFN)- α Interleucina (IL)-1β, IL-6 y IL-12. (Hong et al, 2009).

3.6.3. Otros efectos

Metabolismo del colesterol

Han sido investigados los efectos del Kéfir sobre el índice de aterogenicidad (IA) en

conejos machos blancos de Nueva Zelanda con una dieta alta en colesterol (0,5%). Al

grupo control (n=7) no le fue administrado kéfir mientras que al grupo del kéfir sí (n=8).

Mediante técnica histoquímica la aorta fue analizada y las lesiones arteriosclerótico

cuantificadas. Lípidos y azucares también fueron medidos. La formación de células

RAW264.7 por lipoproteína de muy baja densidad (βVLDL) fue investigada en ambos

grupos. Los resultados obtenidos encontraron diferencias significativas en las lesiones

arterioscleróticas, las cuales eran menores en el grupo, al cual le fue suministrado

kéfir. En cuanto a la concentración de colesterol en el hígado se coincidió también en

que en el grupo del kéfir era menor (Uchida et al., 2010)

Impacto en el tracto gastrointestinal

La composición de la microbiota intestinal se ve afectada por la ingesta de kéfir, lo

cual puede ser debido a la combinación de la inhibición directa de patógenos por parte

de los ácidos y la producción de bacteriocinas (Rattray et O´Connel, 2011). Estudios

11

in-vitro llevados a cabo sobre células epiteliales intestinales han evidenciado que

microorganismos aislados del kéfir poseen capacidad para antagonizar el efecto de

patógenos intestinales, tales como Escherichia coli, Salmonella spp. y Shigella spp

(Iraporda, 2016).

Bioconservante

Las industrias sufren grandes pérdidas económicas por la contaminación fúngica de

los alimentos para el ganado. Además del riesgo que supone para la salud de los

animales. Se ha demostrado que el suero de leche fermentado con granos de kéfir

añadido a los alimentos de aves de corral actúa como un bioconservante, evitando la

contaminación por hongos y aumentando su vida útil (Londero et al., 2014).

Alternativa para la intolerancia a la lactosa

En la fermentación del kéfir, la lactosa se ha digerido en sus dos componentes. Una

vez ingerida esta bebida no es necesario la presencia de la enzima lactasa para

digerirla. Aportando el kéfir los beneficios de la leche sin dificultar la digestión.

Presión arterial

Estudios recientes indican que la administración a largo plazo de la fracción no

bacteriana del kéfir, produce una disminución en la presión arterial y de la hipertrofia

cardiaca en un experimento con ratas Wistar espontáneamente hipertensas. Se cree

que esto es debido a la inhibición de la Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA)

y a la disminución de la relación citoquinina inflamatoria-antiinflamatoria (Brasil et al.,

2018).

12

4. OBJETIVOS

Los objetivos de este estudio son:

-Determinación de la microbiota del kéfir tradicional

-Detección de microorganismos con actividad antimicrobiana

13

5. MATERIAL Y MÉTODOS

5.1. Muestras del Kéfir

A lo largo de la etapa experimental se trabajó con dos muestras de kéfir de leche, ya

que es el más comúnmente consumido, las cuales diferían en su origen. Una fue

adquirida en un supermercado y otra a partir de los gránulos de kéfir de forma casera.

Las muestras recolectadas fueron clasificadas bajo la siguiente nomenclatura:

o Kéfir de supermercado: KS

o Kéfir elaborado de forma artesanal: KF

5.2. Medios de cultivo

Se utilizaron 4 medios generales para el crecimiento bacteriano; TSA, MRS-agar, YMA

y McConkey agar. Por otro lado se utilizó BHA tamponado blando y BHA tamponado

e YMB medios utilizados para el ensayo de la actividad antimicrobiana.

Todos los medios tras su preparación fueron esterilizados en autoclave a 121ºC.

Atemperados a 50ºC y vertidos en las placas de Petri a razón de 15 ml en cada una

de ellas. Siempre en condiciones de esterilidad, trabajando al lado del mechero para

evitar cualquier posible contaminación. Tras esto se dejan enfriar y se mantienen en

la cámara frigorífica para su posterior uso.

o Medio Tripticase Soy Agar (TSA):

Es un medio de uso generalizado para el cultivo una amplia variedad de

microorganismos. La adición de un 5% de sangre proporciona un medio no-

selectivo para la visualización de reacciones hemolíticas por parte de algunas

especies bacterianas.

Se prepararon 800 ml siguiendo las recomendaciones del fabricante. La marca

comercial utilizada fue Panreac Applichen.

Su composición de reactivos por litro de agua destilada es la siguiente:

Reactivos Peso (gramos)

Digerido pancreático de caseína 14,5

Digerido papaico de harina de

soja

5,0

Cloruro sódico 5,0

14

Agar 14,0

Factores de crecimiento 1,5

o Medio DE MAN, ROGOSA, SHARPE agar (MRS-agar):

Se trata de un medio natural selectivo que permite el aislamiento, cultivo y

enumeración de Lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas de alimentos y

otros materiales.

Se prepararon 800 ml según las recomendaciones del fabricante, la marca

comercial del producto correspondía con la casa Scharlau. La composición de

reactivos por litro de agua destilada es la siguiente:


Mezcla de peptona 18.0

Extracto de levadura 4.0

Glucosa 20.0

Tween 80 1.0

Fosfato dipotasio de hidrógeno 2.0

Citrato triamonio 2.0

Acetato de sodio anhidro 3.0

Sulfato de magnesio 7 H₂O 0.2

Sulfato de magnesio anhidro 0.034

Agar 12.0

o Medio Yeast Malt Agar (YMA):

Se trata de un medio de cultivo selectivo que permite el crecimiento de

levaduras.

Se prepararon 800 ml según las indicaciones del fabricante, el producto

pertenecía a la marca Panreac. La composición de reactivos por litro de agua

destilada es la siguiente:


Manitol 10.0

Extracto de levadura 4.0

15

K₂POH₄ 0.5

MgSO₄ 0.2

NaCl 0.1

Agar 15

Rojo Congo 81g/400 ml

o Medio MacConkey Agar:

Este medio es utilizado para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

desarrollo, aerobios y anaerobios. En este medio las peptonas aportan los

nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de

carbono no fermentable y la mezcla del cristal violeta junto con las sales biliares

son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora

Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa,

disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del

indicador de pH, la absorción en las colonias y la precipitación de las sales

biliares.

Fueron preparados 800 ml según recomendaciones del fabricante de la casa

Scharlau.

La composición de reactivos por litro de agua destilada es la siguiente:


Digerido pancreático de gelatina 17.0

Digerido pancreático de caseína 1.5

Digerido péptico de tejido animal 1.5

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 1.5

Cloruro de sodio 5.0

Rojo neutro 30.0

Cristal violeta 1.0

Agar 13.5

o Medio Brain Heart Infusion-agar tamponado (BHA-T):

16

Medio utilizado como capa base para el ensayo de la actividad antimicrobiana

en placas de Petri.

Se prepararon 800 ml siguiendo la receta que se detalla más abajo. Los

productos comerciales usados pertenecían a la marca Panreac y BHB

perteneciente a la casa Fluka Analytical. Se trata de un medio utilizado para el

ensayo


Fosfato dibásico 3.5

Fosfato monobásico 1.505

Agar 5.95

BHA 12.95

H₂O 350 ml

o Medio Brain Heart Infusion-agar blando y tamponado (BHA-T):

Medio empleado como sobrecapa para cubrir la capa base tras la inoculación

de la bacteria patógena.

Fueron preparados 350 ml siguiendo la receta que se adjunta más abajo. Se

hirvió en microondas y se dispuso en tubos a razón de 6 ml para a continuación

ser esterilizado. Los productos fueron adquiridos de la marca comercial

Panreac excepto BHA el cual pertenecia a la marca Fluka Analytical.


Fosfato dibásico 3.5

Fosfato

monobásico

1.4

Agar 2.8

BHA 5.25

H₂O 350 ml

o Yeast Malt Broth (YMB):

Medio empleado como capa base para el ensayo de la actividad

antimicrobiana.

17

Fueron preparados 350 ml según las recomendaciones del fabricante en placas

de Petri. Además se añadió Agar para la solidificación. Se utilizó la marca

comercial de Scharlau.


Destroxe 10,0

Peptone 5,0

Malt extract 3,0

Yeast extract 3,0

Agar 18,0

o Yeast Malt Broth-blando (YMB):

Medio empleado como sobrecapa para cubrir la capa base tras la inoculación

con la bacteria indicadora en el ensayo para la detección de actividad

antimicrobiana.

Se prepararon 350 ml siguiendo las recomendaciones del fabricante al igual

que la capa. En este caso se añadió Agar al 85%. Dicho medio fue previamente

hervido y dispuesto en tubos a razón de 6ml para a continuación esterilizarlo

en el autoclave.


Dextrosa 10,0

Peptona 5,0

Extracto de Malta 3,0

Extracto de levadura 3,0

Agar (85%) 18,0

5.3. Material de laboratorio

1. Placas Petri

2. Mechero Bunsen

3. Asa de siembra

4. Guantes

5. Matras

6. Balanza de precisión

18

7. Pipetas y micropipetas

8. Puntas estériles

9. Agua destilada

10. Matraces estériles

11. Gradillas

12. Eppendorfs

13. Tubos de ensayo

14. Torres de acero inoxidable

15. Pinzas estériles

16. Alcohol

17. Portaobjetos

18. Microscopio

19. Estufa

20. Centrífuga

5.4. Bacterias indicadoras utilizadas

Las bacterias indicadoras utilizadas fueron Enterococcus faecalis S-47,

Staphylococcus aureus y Listereia innocua. Dichas cepas fueron sembradas el día

anterior al ensayo, para evitar que perdieran su virulencia. Este proceso fue llevado a

cabo por el personal del departamento de microbiología en la Universidad de Jaén.

5.5. Determinación de la microbiota del kéfir

Técnica de diluciones seriadas

Es el primer paso que se lleva a cabo para la identificación y aislamiento de los

microorganismos presentes en los gránulos de kéfir. Para ello a partir de la muestra

madre, muy concentrada se preparan diluciones al décimo (1:10). Obteniéndose una

serie de soluciones relacionadas por un factor de dilución 10, es decir, 1/10, 1/100,

1/1000 y así sucesivamente. (Gálvez & Heras, 2012)

Partimos de dos soluciones madre, ambas formadas por 10 ml de solución salina junto

con 1 gramo aproximadamente de muestra, por un lado el kéfir de supermercado y

por otro el obtenido de forma casera. Anteriormente se han preparado alrededor de

25 eppendorfs con 900 µl de solución salina cada uno. A partir de la solución madre

de la cual se extraen 100 µl y se depositan en un eppendorf y tras pasarlo por el vórtex,

se obtiene la dilución 1/10. De dicha solución se toman otros 100 µl y se pasan a otro

19

eppendorf y de igual manera se obtiene la dilución 1/100. Se procede de esta forma

con ambas muestras por separado hasta llegar a la dilución 10⁻⁵. Obteniendo 5

diluciones por cada muestra original. Todo el proceso se realiza con las máximas

condiciones de esterilidad, trabajando al lado del mechero Bunsen.

Siembra de las soluciones en los medios de cultivo

Se tuvo que diferenciar entre las diluciones procedentes de la muestra del kéfir de

supermercado (KS) y las procedentes del kéfir obtenido de forma manual (KF). Se

realizó la siembra de cada dilución por duplicado en cada medio, es decir, partiendo

de 5 diluciones seriadas y dos replicas por cada una de ellas, se obtuvo un total de 10

placas de KS en cada medio de TSA, MRS, YMA y MacConkey. Igualmente con las

diluciones procedentes de KF.

Tras agitar las diluciones en el vórtex, se procedió a la siembra de estas, desde la más

diluida (10⁻⁵) hasta la menos diluida (10⁻¹). Se tomó 100 µl de cada dilución y se

depositó sobre la placa. Tras flamear el asa de siembra, se extendió dicha alícuota

por toda la placa, siguiendo una siembra en césped. Dicho proceso tuvo lugar en

condiciones de esterilidad. A continuación, las placas de YMA y MRS sembradas se

incubaron a 30ºC y las de TSA y McConkey a 35ºC durante 24 horas en la estufa.

Aislamiento de colonias

En primer lugar, se realizó el recuento de colonias de aquellas placas más favorables.

Para ello por cada medio tendremos que contar aquella placa que sea más

conveniente junto con su respectiva replica. Por lo tanto, por un lado tendremos el

recuento de 2 placas de KS y 2 de KS respectivamente, en cada medio de cultivo.

Tras el recuento, se seleccionaron las colonias procedentes de los medios de cultivo

MRS e YMA agar, intentando que fueran diferentes en cuanto a su morfología. A

continuación, mediante el asa de siembra se picaron las colonias y fueron sembradas

siguiendo la técnica de agotamiento en el medio YMA y MRS agar según el medio de

procedencia. Además las placas fueron rotuladas en cuanto a si se trataban de

colonias procedentes de kefir de supermercado o al obtenido de forma casera para

evitar una posterior confusión, además del número de colonia, obteniendo un total de

22 colonias. Estas placas se dejaron incubar en la estufa a 30ºC durante 24 horas.

Conservación de las colonias

20

Tras el crecimiento de las colonias en el medio de cultivo con el fin de aumentar la

concentración de las mismas para su uso posterior en las diferentes pruebas que se

realizaran. Sera necesario que sean sembradas en tubos de medio MRS e YMA

líquido, los cuales serán incubados durante 24 horas a 30ºC en la estufa. Después fue

comprobado su crecimiento, a través de la turbidez que presentaban. La turbidez

indica crecimiento. Tras el crecimiento en los tubos de medio líquido se desecharon

las que no crecieron y el resto se conservó en la cámara frigorífica. De igual modo

cada tubo fue identificado dependiendo de la cepa de la cual se tratara. Todo ello en

condiciones de esterilidad para evitar cualquier contaminación.

5.6. Identificación preliminar de microorganismos de interés

Se realizó una identificación previa sobre las cepas bacterianas presentes en las

muestras de kéfir con el fin posterior de conocer con qué clase de microorganismo se

estaba trabajando. Para ello se utilizó la tinción de Gram.

Tinción de Gram

Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de su

composición para que el microorganismo sea considerado gram positivo o gram

negativo. La diferencia existente entre microorganismos Gram positivos y Gram

negativos reside en la composición de su pared celular. Mientras que los Gram

positivos poseen una pared monoestratificada, con ácidos teitoicos y más mureína en

la cual queda atrapado el cristal violeta tiñiendose de azul/morado. Los Gram

negativos tienen una pared celular biestratificada y no poseen ácidos teitoicos por lo

que el cristal violeta no queda atrapado y son teñidas con la safranina quedando de

color rojo. Para ello se emplean dos colorantes; cristal violeta de carácter primario y

safranina que actúa de contraste. El lugol sirve como fijador de la safranina y un

decolorante como el alcohol. Esta técnica nos permite diferenciar entre bacilos, cocos

y cocobacilos.

En primer lugar, tras seleccionar la colonia crecida en la placa de medio MRS e YMA

agar, con el asa de siembra se extiende sobre un portaobjetos en el cual previamente

se colocado una gota de agua destilada. Fijamos las bacterias por calor, colocando el

portaobjetos a una distancia suficiente del mechero bunsen con cuidado de no

destruirlas. Una vez fijadas, se aplican los colorantes, primero se añade cristal violeta

el cual se deja actuar alrededor de dos minutos. Tras esto, se aplica lugol durante dos

21

minutos y seguidamente se lava con alcohol unos 30 segundos. Para retirar el alcohol

lavamos con agua destilada. En el último paso, añadimos safranina durante 3 minutos.

Después se lava con agua destilada, se seca la preparación y se observa al

microscopio.

5.7. Detección de la actividad antimicrobiana

5.7.1. En medio sólido

Método de cruces

A partir de los tubos de medios MRS e YMA líquido que anteriormente habíamos

sembrado, se realiza una siembra en cruz mediante el asa de siembra en los medios

BHA-T e YMB previamente preparados. De tal forma que las cepas procedentes del

medio líquido MRS serán sembradas en el medio BHA-T y las procedentes del medio

líquido YMA en el medio sólido YMB.

En cada placa habrá en torno a unas 4 cepas juntas, con cuidado de que no se solapen

unas con otras para ver la actividad microbiana que presentan sin ninguna dificultad.

Tendremos que realizar tres réplicas, ya que probaremos la actividad que presentan

nuestras cepas frente a tres patógenos distintos; Enterococcus faecalis S-47,

Staphylococcus aureus y Listereia innocua. Las placas serán incubadas a 30ºC

durante 24 horas.

Técnica de las sobrecapas

Son necesarias las cepas patógenas las cuales fueron proporcionadas por el

departamento de microbiología de la Universidad de Jaén.

En primer lugar, las sobrecapas tanto del medio BHA-T e YMB solidificadas, fueron

fundidas en el baño termostático a una temperatura de 90ºC-100ºC. Tras fundirse,

fueron atemperadas en torno a unos 50ºC. Una vez atemperadas se pipetearon 60 µl

de bacteria patógena al medio que correspondiese todo ello muy rápido y en

condiciones de esterilidad, ya que el medio tiende a solidificar. Se pasa por el vórtex

y se deja caer sobre las placas, en las cuales están sembradas nuestras cepas en

cruces, dejando que se expanda sobre toda la placa. Dichas placas son incubadas a

30ºC durante 24 horas. La finalidad de este método es observar un halo de inhibición,

lo cual indicará que nuestras bacterias presentan actividad antimicrobiana frente a

dichas bacterias patógenas.

22

5.7.2. En medio líquido

Técnica de ensayo con pocillos (Tagg y McGiven, 1971)

Previamente se deben de autoclavar los pocillos y las pinzas para su posterior

utilización. Además de cultivar aquellas cepas que han presentado halo de inhibición,

lo cual indica como hemos comentado anteriormente que presentan actividad

antimicrobiana. Para el cultivo, tomaremos 20 µl de dichas cepas en 2 ml de los

medios líquidos MRS e YMA. Dejaremos los tubos durante 24 horas a 30ºC.

Una vez han crecido las cepas, las pasaremos a eppendorfs y las centrifugaremos a

14.000 rev/min durante 10 minutos, obteniendo el sobrenadante en el cual

encontraremos todas aquellas sustancias producidas por nuestras bacterias del medio

de cultivo y resto celulares que quedarán depositados en el fondo. Tras una primera

centrifugación recogeremos el sobrenadante en eppendorfs nuevos y se volverán a

centrifugar a 14.000 rev/min durante 10 minutos, asegurando que en el sobrenadante

no encontremos bacterias.

Mientras tanto las sobrecapas son fundidas y posteriormente atemperadas en el baño

termostático para su posterior uso. Igual que para el método anterior necesitaremos 3

réplicas para cada uno de los patógenos.

En las placas de BHA-T e YMB colocaremos los pocillos de acero inoxidable, a razón

de unos 4-5 pocillos por placa evitando que se interfiera en el resultado de las

diferentes muestras localizadas en cada uno de ellos. Tras la colocación, se vierten

los 6 ml de sobrecapas de YMB y BHA-T blando según corresponda, a las cuales se

les añaden 60 µl de bacteria patógena, pasándose por el vórtex y quedando estas

homogéneamente por la placa sin que llegue a sobrepasar los pocillos.

Tras la solidificación de las sobrecapas, se continua con la retirada de los pocillos con

ayuda de unas pinzas esterilizas con sumo cuidado. Obteniendo como resultado una

pequeña oquedad dónde más tarde verteremos 85µl del sobrenadante.

Por último, incubaremos dichas placas durante 24 horas a 30ºC. Transcurrido este

período de tiempo podremos observar la presencia o ausencia de halo de inhibición,

incluido el diámetro de este.

23

6. RESULTADOS

6.1. Determinación de la comunidad microbiana del kéfir

Se seleccionaron aquellas placas más favorables para realizar el recuento, es decir

las que tuvieran entre 30 y 300 colonias aproximadamente. Por lo tanto, por cada

medio y muestra fueron escogidas dos réplicas pertenecientes ambas a la misma

dilución. A continuación, se calculó la media del número de colonias presentes en

ambas réplicas y se continúo con el cálculo de unidades formadoras de colonias por

ml (UFC/ml) a partir de la siguiente fórmula:

𝑈𝐹𝐶/𝑚𝑙 =𝑛º 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠

𝑚𝑙 𝑒𝑛 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

En la tabla 2 fueron recogidos los resultados obtenidos.

MEDIOS MUESTRAS DILUCIONES Nº

COLONIAS

MEDIA EN

UFC/ML

TSA Kéfir supermercado

(KS)

10⁻5 392 344 3,6 x 108

Kéfir casero (KF) 10⁻5 260 220 2,4 x 108

MRS KS 10⁻3 157 183 1,7 x 106

KF 10⁻4 171 198 1,8 x 107

YMA KS 10⁻3 129 112 1,2 x 105

KF 10⁻4 97 106 1,0 x 107

McConkey KS 10⁻3 125 127 1,2 x 106

KF - - - -

Tabla 2. Resultados del recuento de microorganismos (UFC/ml) presentes en las

muestras de kéfir.

Estos datos experimentales tabulados, serán expresados en las siguientes

gráficas. En concreto analizaremos las diferencias entre las unidades formadoras

de colonias por mililitro (UFC/ml) según el tipo de muestra. Para una mayor

comodidad, dichos datos fueron pasados a escala logarítmica.

24

Gráfica 1. Representación gráfica del número de UFC/ml en el kéfir de supermercado

Se observa un crecimiento superior en el medio general TSA respecto al resto,

esto es debido a que se trata de un medio general, dónde se busca la carga límite

bacteriana (Gráfica 1). Se observa que en el resto de medios la cantidad de UFC/ml

es similar. Se advierte una presencia de 1,2 x 105 UFC/ml en el medio YMA, lo que

ratifica la presencia de levaduras en la composición microbiológica del kéfir. En el

medio MRS, se contempla 1,7 x 106 UFC/ml una cantidad por encima de la

encontrada en el medio YMA, indicando una mayor presencia de bacterias ácido

lácticas que de levaduras (Gráfica 1).

Por último, el crecimiento en el medio de cultivo McConkey indica la presencia de

enterobacteria, en concreto un número de 1,2 x 106 UFC/ml (Gráfica 1). Según el

Instituto Nacional de Alimentos esto podría ser debido a una contaminación en la

cadena de elaboración del producto, más concretamente a una contaminación post

tratamiento térmico.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

TSA YMA MRS McConkey

UFC/ml

KÉFIR DE SUPERMERCADO

25

Gráfica 2. Representación gráfica del número de UFC/ml en el Kéfir casero

Los datos obtenidos para el kéfir obtenido de forma casera al igual que para el kéfir

de supermercado, presenta una carga bacteriana superior en medio TSA, la

presencia de levaduras por el crecimiento en medio YMA y un mayor número de

UFC/ml de bacterias ácido lácticas que de levaduras (Gráfica 2). En medio

McConkey no se observa ningún crecimiento, por lo que se descarta la presencia

de enterobacterias en el kéfir casero (Gráfica 2)

Gráfica 3. Comparación del número de UFC/ml entre el kéfir de supermercado y el

casero

En esta última gráfica (Gráfica 3), se pueden observar las diferencias entre el número

de UFC/ml en el kéfir de supermercado y el kéfir casero. Se observan diferencias

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

TSA YMA MRS McConkey

UFC/ml

KÉFIR CASERO

26

significativas entre la concentración de bacterias ácido lácticas y levaduras, siendo

mayor en el kéfir casero, 1,8 x 107 UFC/ml y 1,0 x 107 UFC/ml respectivamente.

Además, se advierte una leve diferencia de microorganismos siendo mayor en el kéfir

de supermercado que en el kéfir casero. Por último, sólo se perciben enterobacterias

en el kéfir de supermercado.

6.2. Selección de los microorganismos de interés e identificación preliminar

En primer lugar, se llevó a cabo el aislamiento de las colonias tanto del medio de

cultivo MRS e YMA, intentado que difirieran en cuanto a su morfología a nivel

macroscópico. Tras el aislamiento, dichas colonias fueron sometidas a una tinción de

Gram, donde pudimos conocer tanto si pertenecían a microorganismos Gram positivos

o negativos. Además de si correspondían a bacilos, cocos o levaduras dependiendo

de su morfología microscópica.

La nomenclatura utilizada fue la siguiente; se diferenció entre el tipo de muestra, la

perteneciente al kéfir de supermercado se denominó por KS y la perteneciente al kéfir

artesanal por KF seguido del número de colonia aislada empezando por la 1, 2, 3,…

y así sucesivamente.

A continuación, se muestran los resultados obtenidos de esta selección preliminar

(Tabla 3):

COLONIA MEDIO DE CULTIVO MORFOLOGIA TINCIÓN

KS1 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram -

KS2 YMA Colonia grande blanca Coco Gram -



KS5 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram-

KS6 YMA Colonia pequeña blanca Bacilo Gram-

KF8 YMA Colonia grande blanca mucosa Levadura

KF9 YMA Colonia mediana blanca mucosa Levadura

KF10 YMA Colonia pequeña blanca mucosa Levadura



KF13 YMA Colonia pequeña blanca mucosa Coco Gram +

KF14 MRS Colonia pequeña blanca mucosa Levadura

27

KF15 MRS Colonia grande blanca mucosa Levadura

KF16 MRS Colonia mediana blanca mucosa Levadura

KF17 MRS Colonia mediana blanca mucosa Bacilo Gram -

KS18 MRS Colonia grande blanca mucosa Bacilo Gram -

KS19 MRS Colonia grande blanca mucosa Bacilo Gram -

KS20 MRS Colonia mediana blanca mucosa Bacilo Gram -

KS21 MRS Colonia mediana blanca mucosa Coco Gram +

KS22 MRS Colonia pequeña blanca mucosa Bacilo Gram -

Tabla 3. Resultados de la tinción de Gram

6.3. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio sólido

Para evaluar la actividad antimicrobiana que poseían las colonias aisladas se llevó a

cabo el método de cruces. El objetivo de esta técnica fue la observación de halos de

inhibición producidos por estas frente a las bacterias indicadoras. La presencia de un

halo de inhibición alrededor de las cepas sembradas en cruz sugeriría que la presencia

de estas inhibe el crecimiento de las bacterias patógenas. A continuación, se muestran

los resultados obtenidos (Tabla 4):

BACTERIAS INDICADORAS

COLONIAS MEDIO MORFOLOGIA S. aureus E. faecalis S-47 L. innocua

KS1 YMA Bacilo Gram - ++ (6mm) + ++ (3mm)

KS2 YMA Coco Gram - ++ (2mm) + ++ (10mm)

KS3 YMA Bacilo Gram - - - +

KS4 YMA Bacilo Gram - - - -

KS5 YMA Bacilo Gram - ++ (2mm) + +

KS6 YMA Bacilo Gram - ++ (6mm) - ++ (4mm)

KF8 YMA Levadura +++(10mm) - +++(5 mm)

KF9 YMA Levadura - - -

KF10 YMA Levadura +++(5,5mm) - +

KF11 YMA Levadura +++ (7mm) + +

KF12 YMA Levadura +++(6,5mm) + +

KF13 MRS Coco Gram + + + +

KF14 MRS Levadura - + -

KF15 MRS Levadura - + -

KF16 MRS Levadura - + +

KF17 MRS Bacilo Gram - + + -

KS18 MRS Bacilo Gram - - - +

KS19 MRS Bacilo Gram - + + +

28

KS20 MRS Bacilo Gram - + + +

KS21 MRS Coco Gram + + + -

KS22 MRS Bacilo Gram - ++ - -

Tabla 4. Actividad antimicrobiana de los aislados de kéfir

Se estableció una escala para medir la presencia de halo de inhibición. Por un lado la

presencia fue representada por “+” y dependiendo si esta era más o menos intensa

por “++” o “+++”. Mientras que la ausencia de halo fue representada por “-“. Entre las

colonias que presentaron halo, este fue medido en el caso de que fuera posible, en

milímetros.

Se observa como en la mayoría de los casos las colonias aisladas presentan actividad

antimicrobiana frente a las bacterias patógenas (Ilustraciones 4 y 5). Se podría citar la

intensa actividad de la colonia KF10, KF11, KF12 y KS5 frente a Staphylococcus

aureus.

Ilustración 4. Halo de inhibición frente a Ilustración 5. Halo de inhibición frente a L. inocua

S. aureus

6.4. Determinación de la actividad antimicrobiana en medio líquido

Tras centrifugar los cultivos microbianos y quedarnos con la porción no microbiana del

kéfir (Sobrenadante), es decir obviando las células del resto de sustancias liberadas

por ellas. Se pretende comprobar si los compuestos desprendidos por nuestros

microorganismos producían alguna actividad antimicrobiana, observándose un halo

de inhibición del crecimiento por parte de las bacterias indicadoras

29

Sólo se evidencio actividad antimicrobiana para las colonias KS5 y KS6 contra la

bacteria indicadora Staphylococcus aureus. El halo de inhibición de KS5 fue de 5 mm

y de 6 mm para KS6 (Ilustración 6). Ambas colonias pertenecían a la muestra de Kéfir

obtenida en el supermercado. El resto de colonias o bien no presentaron halo o

estaban contaminadas posiblemente por una mala manipulación en la recogida del

sobrenadante tras la centrifugación, pudiéndose recoger parte de la carga bacteriana.

En el caso de las colonias que no han presentado halo de inhibición, excepto las

contaminadas, se puede pensar que dichas colonias presentan las sustancias

inhibidoras pegadas a su pared celular por eso al desechar en la centrifugación las

células bacterianas, no se observó actividad alguna.

Ilustración 6. Presencia de halo de inhibición por parte de las colonias KS5 y KS6 frente a S. aureus.

6.5. Análisis estadístico

Para la evaluación de la existencia de diferencias entre el número de unidades

formadoras de colonias por mililitro entre kéfir de supermercado y kéfir casero, se

utilizó la prueba t-student para muestras independientes, considerando varianzas

desiguales. Los datos se consideraron significativamente distintos cuando el valor de

p fue inferior a 0,05. Para el procesado de datos se utilizó el programa Microsoft Excel.

30

En primer lugar, se establece una hipótesis: El promedio del número de unidades

formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) del kéfir casero es mayor que el del kéfir

de supermercado.

Para llevar a cabo el análisis es necesario la consideración de los siguientes puntos:

H₁ (Hipótesis alternativa): Existen diferencias entre la media de UFC/ml del kéfir

de supermercado y la meda de UFC/ml del kéfir casero.

H0(Hipótesis nula): No existen diferencias entre la media de UFC/ml de ambas

muestras.

El nivel de significación, α, tomado suele ser 0,05.

Si p-valor ≥ α se acepta H0. Por lo tanto, no existen diferencias significativas

entre las medias de ambas muestras.

Si p-valor ≤ α se acepta H1. Por lo tanto, existen diferencias significativas entre

las medias de ambas muestras.

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales

Kéfir supermercado

Kéfir casero

Media 6,486278 5,658871

Varianza 2,165366 14,59188

Observaciones 4 4

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 4

Estadístico t 0,404248

P(T<=t) una cola 0,353356

Valor crítico de t (una cola) 2,131847

P(T<=t) dos colas 0,706712

Valor crítico de t (dos colas) 2,776445

El p-valor obtenido es de 0,706712 > 0,05 por lo que aceptamos la hipótesis nula, no

existen diferencias significativas entre las medias de ambas muestras.

7. DISCUSIÓN

En los últimos años un tema de interés creciente ha sido el consumo de alimentos

probióticos que contribuyan a la salud y al bienestar, especialmente a aquellos que

reducen el riesgo de padecer enfermedades (Iraporda, 2016).

31

Actualmente, el kéfir es reconocido como una fuente potencial de probióticos y

moléculas con propiedades altamente saludables muy interesantes. El estudio y la

caracterización de la composición del kéfir ha contribuido a abrir nuevas posibilidades

para su aplicación en el ámbito de la industria alimenticia (Prado et al., 2015). Es por

ello, que el objeto de nuestro estudio ha sido la caracterización de la microbiota del

kéfir con la finalidad de conseguir cepas con actividad antimicrobiana.

En cuanto al análisis de la composición microbiológica del producto fermentado, no se

encontraron diferencias significativas, según el análisis estadístico llevado a cabo.

Quizás no se encontraron diferencias porque el tamaño de la muestra no era lo

suficientemente representativo. En ambas muestras se cotejo una concentración de

1,7 x 106 – 1,8 x 107 UFC/ml de bacterias ácido láctica. Mientras que en levaduras el

valor oscilo entre 1,2 x 105 – 1,0 x 107 UFC/ml. Se reveló la presencia de

enterobacterias aisladas de la muestra procedente del supermercado, lo cual indica

una contaminación en la cadena de elaboración del producto fermentado. Witthum et

al. (2005) evidenciaron que la concentración de bacterias ácido lácticas presentes en

el kéfir puede oscilar desde 6,4 x 104 a 8,5 x 108 UFC/ml y los niveles de levaduras

desde 1,5 x 105 a 3,7 x 108 UFC/ml. Además ha sido reportado la presencia de

bacterias ácido acéticas en el orden de 106 UCF/ml en el producto fermentado por los

gránulos de kéfir (Irigoyen et al, 2005). Comúnmente, existen mayores niveles de

bacterias ácido lácticas que de levaduras en el kéfir. Pese a esto, las condiciones de

fermentación también influyen en la distribución de los microorganismos presentes

tras la fermentación (Magalhães et al., 2011). Para una mejor compresión de la

diversidad microbiana del kéfir, se recomienda el uso de técnicas de secuenciación

masiva, como la pirosecuenciación. Dobson et al. (2011) llevaron a cabo esta técnica

y reportaron la presencia de microorganismos pertenecientes a grupos minoritarios,

no advertidos previamente, los cuales podrían contribuir a las características

sensoriales presentes en la bebida fermentada.

La capacidad inhibitoria presente en el kéfir, quizás sea debido a la compleja

asociación de cepas probióticas que producen sustancias antimicrobianas (Chifiriuc et

al., 2011). En nuestros ensayos pudimos comprobar como en medio sólido en la

mayoría de los casos las colonias aisladas presentan actividad antimicrobiana frente

a las bacterias patógenas. Se podría citar la intensa actividad de la colonia KF10,

KF11 y KF12, las cuales correspondían a una morfología del tipo levadura y KS5,

32

correspondiente a un bacilo Gram negativo, frente a Staphylococcus aureus. Las

levaduras que presentaron actividad antimicrobiana fueron aisladas de la muestra

obtenida de forma casera. Mientras que el bacilo Gram negativo fue obtenido de la

muestra adquirida en el supermercado. Por otro lado, las colonias KF8 y KS1

correspondiente a una morfología del tipo bacilo Gram negativo, presentan una

notable actividad inhibitoria frente a Listeria innocua.

El ensayo en medio líquido, con la fracción no microbiana del cultivo bacteriano, dio

como resultado inhibición del desarrollo de Staphylococcus aureus por parte de las

cepas aisladas KS5 y KS6. Ambas cepas fueron identificadas como bacilos Gram

negativos a partir de la muestra obtenida en el supermercado. El halo de inhibición

para ambas colonias fue de 5-6 mm respectivamente. De modo general, el kéfir

presenta actividad antibacteriana en microorganismos Gram negativos. Aunque en

microorganismo Gram positivos también ha sido evidenciado efectos inhibitorios frente

a microorganismos patógenos (Ahmed et al., 2013). Han sido una considerable

cantidad de estudios los que han reportado actividad antimicrobiana del kéfir frente a

Listeria innocua, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,

Escherichia coli, Listeria monocytogenes (Ahmed et al., 2013). Chifiriuc et al. (2011)

encontraron también que el crecimiento de Enterococcus faecalis y Bacillus subtilis

ssp. Spizizenii eran inhibidas por la fracción no microbiana del kéfir. Ulusoy et al.

(2007) mostraron el efecto inhibitorio producido por el kéfir sobre Staphylococcus

aureus con un diámetro de inhibición que vario desde los 21,1 a los 21,4 mm.

Recientes estudios han demostrado como cepas aisladas de los granos de kéfir, como

Lactobacillus producían zonas de inhibición de 19-22 mm contra Listeria innocua y

Clostridium perfringens respectivamente (Dobson et al., 2011).

8. CONCLUSIONES

La creciente tendencia a consumir productos alimenticios beneficiosos para la salud

ha sido el desencadenante del ensayo llevado a cabo. El kéfir es un ejemplo de un

claro alimento próbiotico debido a los múltiples efectos beneficios conocidos y

estudiados tales como la actividad antimicrobiana en la que hemos centrado dicho

estudio. Ha quedado evidenciado como el kéfir de leche es capaz de inhibir el

crecimiento de patógenos humanos comunes tales como Staphylococcus aureus o

Listeria. Cabe destacar que se observa un mayor número de microorganismos

33

presentes en el kéfir obtenido de forma casera que en el kéfir adquirido en el

supermercado. Además la presencia de enterobacterias en este último nos lleva a

pensar que su consumo, pese a los efectos antimicrobianos encontrados, no sería

muy seguro.

Por último, se debería disponer de un número mayor de trabajos sobre la composición

química presente en el kéfir, así como de los mecanismos de acción los cuales tienen

lugar in-vivo que aportan beneficios a la salud de humanos. Un sólido conocimiento

acerca de esta bebida sería posible con una mayor experimentación, lo cual permitiría

un uso más racional de esta bebida y un impacto en su consumo.

34

9. BIBLIOGRAFÍA

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http://www.anmat.gov.ar/Alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_microbiologic

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